survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡及增強紫杉醇敏感性的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一員,是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子之一。對細(xì)胞凋亡和分裂周期有雙重調(diào)控作用:survivin直接作用于caspase,主要抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白caspase-3和caspase-7或干擾caspase-9的活性,阻斷由各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的共同通路;survivin特異性表達(dá)于G2/M期,通過與有絲分裂紡錘體的微管結(jié)合,參與對細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于其具有選擇性表達(dá)于胚胎和腫瘤組織而在絕

2、大多數(shù)正常終末分化組織不表達(dá)的特點,可能成為腫瘤診斷的標(biāo)志物以及腫瘤基因治療的新靶點。本實驗設(shè)計高特異性survivin反義寡核苷酸序列,并全程硫代修飾,經(jīng)脂質(zhì)體包裹,轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞,研究survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增殖抑制作用,以及反義寡核苷酸能否增強胃癌細(xì)胞對紫杉醇作用的敏感性,為胃癌的基因治療提供一個新的的靶點及相關(guān)理論依據(jù)。
   目的: 研究轉(zhuǎn)染生存素(survivin)反義寡核苷酸(anti

3、sense oligonucleotide , Asodn)抗腫瘤作用以及是否增強紫杉醇敏感性;并探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
   方法: 人工合成反義寡核苷酸(Asodn),經(jīng)脂質(zhì)體包裹,將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染情況,MTT觀察反義寡核苷酸對SGC7901胃癌細(xì)胞增殖抑制作用,Westernblot及RT-PCR分別檢測survivin蛋白、caspase-3蛋白及su

4、rvivin mRNA表達(dá),熒光分光光度計檢測 caspase-3 活性變化,Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)改變及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
   結(jié)果: ①熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察反義寡核苷酸成功轉(zhuǎn)染入SGC7901細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察反義寡核苷酸(Asodn)組細(xì)胞變圓、折光增強、漂浮、細(xì)胞碎片形成等變化,而Control組、Lip組和Sodn組細(xì)胞貼壁生長良好,呈梭形;Hoechst染色觀察Control組、Lip

5、組和Sodn組細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,而Asodn組細(xì)胞核染色增強,核質(zhì)濃縮,核碎裂,呈明顯凋亡形態(tài)改變。② 用與同濃度、同時間點的Control組、Lip組及Sodn組相比,Asodn組細(xì)胞增殖抑制率明顯增高(P<0.05)。100~500 nmol/L Asodn 作用24 h、48 h和72 h。后均不同程度的抑制胃癌細(xì)胞的增殖,500 nmol/Lasodn作用24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率分別為(47.9±0.8)%、

6、(67.4±0.5) %和(69.0±3.1)%,作用時間越長,抑制率越高,抑制率與時間呈正相關(guān)(r48 h=0.800, P=0.000; r72 h=0.525, P=0.008);隨轉(zhuǎn)染濃度增高,抑制率也增高,抑制率與Asodn濃度呈劑量依賴關(guān)系(r500=0.708 P=0.01; r400=0.697, P=0.012; r300=0.895 P=0.000; r200=0.809 P=0.001)。100 nmol/L轉(zhuǎn)染4

7、8h時抑制率僅(39.2±5.0)%,500 nmol/L時高達(dá)(67.4±0.5)%。③ 與Control組、Lip組、Sodn組比較,Asodn組survivin蛋白及survivin mRNA表達(dá)降低,光密度比值均有差異,且有統(tǒng)計學(xué)意義(F=807.7, P=0.000; F=658.5, P=0.000)。④ 轉(zhuǎn)染Asodn后caspase-3活性表達(dá)增強(F=2963.6, P=0.000),蛋白表達(dá)增加(F=164.7, P

8、=0.000);⑤ 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Asodn組凋亡率(14.49±1.21)%明顯高于Control組(3.05±0.70)%、Lip組(3.52±0.63)%、Sodn組(3.21±0.82)% (F=472.3, P =0.000)。⑥ Asodn聯(lián)合紫杉醇組其增殖抑制率(78.1±0.8%)明顯高于單純Asodn組(54.9±3.6% )、紫杉醇組(56.7±0.7%)(F=138.3, P=0.000 );Asodn聯(lián)合紫杉

9、醇使單獨使用紫杉醇細(xì)胞凋亡率從(13.16±1.20)% 提高到(28.52±0.91)% (F=5505.4, P=0.000 )。提示轉(zhuǎn)染survivin Asodn能增加胃癌細(xì)胞對紫杉醇作用的敏感性。
   結(jié)論: ① 轉(zhuǎn)染survivin反義寡核苷酸能抑制SGC7901胃癌細(xì)胞的增殖,抑制率與時間濃度呈依賴關(guān)系。② survivin反義寡核苷酸對紫杉醇有增敏作用。③ survivin反義寡核苷酸下調(diào)survivin蛋白及

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