survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)紫杉醇敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一。對(duì)細(xì)胞凋亡和分裂周期有雙重調(diào)控作用：survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白caspase-3和caspase-7或干擾caspase-9的活性，阻斷由各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的共同通路；survivin特異性表達(dá)于G2/M期，通過與有絲分裂紡錘體的微管結(jié)合，參與對(duì)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于其具有選擇性表達(dá)于胚胎和腫瘤組織而在絕

2、大多數(shù)正常終末分化組織不表達(dá)的特點(diǎn)，可能成為腫瘤診斷的標(biāo)志物以及腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)高特異性survivin反義寡核苷酸序列，并全程硫代修飾，經(jīng)脂質(zhì)體包裹，轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞，研究survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增殖抑制作用，以及反義寡核苷酸能否增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇作用的敏感性，為胃癌的基因治療提供一個(gè)新的的靶點(diǎn)及相關(guān)理論依據(jù)。
　　 目的: 研究轉(zhuǎn)染生存素(survivin)反義寡核苷酸(anti

3、sense oligonucleotide , Asodn)抗腫瘤作用以及是否增強(qiáng)紫杉醇敏感性；并探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　 方法: 人工合成反義寡核苷酸(Asodn)，經(jīng)脂質(zhì)體包裹，將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染情況，MTT觀察反義寡核苷酸對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖抑制作用，Westernblot及RT-PCR分別檢測(cè)survivin蛋白、caspase-3蛋白及su

4、rvivin mRNA表達(dá)，熒光分光光度計(jì)檢測(cè) caspase-3 活性變化，Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)改變及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果: ①熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察反義寡核苷酸成功轉(zhuǎn)染入SGC7901細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察反義寡核苷酸(Asodn)組細(xì)胞變圓、折光增強(qiáng)、漂浮、細(xì)胞碎片形成等變化，而Control組、Lip組和Sodn組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，呈梭形；Hoechst染色觀察Control組、Lip

5、組和Sodn組細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而Asodn組細(xì)胞核染色增強(qiáng)，核質(zhì)濃縮，核碎裂，呈明顯凋亡形態(tài)改變。② 用與同濃度、同時(shí)間點(diǎn)的Control組、Lip組及Sodn組相比，Asodn組細(xì)胞增殖抑制率明顯增高(P<0.05)。100~500 nmol/L Asodn 作用24 h、48 h和72 h。后均不同程度的抑制胃癌細(xì)胞的增殖，500 nmol/Lasodn作用24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率分別為(47.9±0.8)％、

6、(67.4±0.5) ％和(69.0±3.1)％，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越高，抑制率與時(shí)間呈正相關(guān)(r48 h=0.800, P=0.000; r72 h=0.525, P=0.008)；隨轉(zhuǎn)染濃度增高，抑制率也增高，抑制率與Asodn濃度呈劑量依賴關(guān)系(r500=0.708 P=0.01; r400=0.697, P=0.012; r300=0.895 P=0.000; r200=0.809 P=0.001)。100 nmol/L轉(zhuǎn)染4

7、8h時(shí)抑制率僅(39.2±5.0)％，500 nmol/L時(shí)高達(dá)(67.4±0.5)％。③ 與Control組、Lip組、Sodn組比較，Asodn組survivin蛋白及survivin mRNA表達(dá)降低，光密度比值均有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=807.7, P=0.000; F=658.5, P=0.000)。④ 轉(zhuǎn)染Asodn后caspase-3活性表達(dá)增強(qiáng)(F=2963.6, P=0.000)，蛋白表達(dá)增加(F=164.7, P

8、=0.000)；⑤ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Asodn組凋亡率(14.49±1.21)％明顯高于Control組(3.05±0.70)％、Lip組(3.52±0.63)％、Sodn組(3.21±0.82)％ (F=472.3, P =0.000)。⑥ Asodn聯(lián)合紫杉醇組其增殖抑制率(78.1±0.8％)明顯高于單純Asodn組(54.9±3.6％ )、紫杉醇組(56.7±0.7％)(F=138.3, P=0.000 )；Asodn聯(lián)合紫杉

9、醇使單獨(dú)使用紫杉醇細(xì)胞凋亡率從(13.16±1.20)％ 提高到(28.52±0.91)％ (F=5505.4, P=0.000 )。提示轉(zhuǎn)染survivin Asodn能增加胃癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇作用的敏感性。
　　 結(jié)論: ① 轉(zhuǎn)染survivin反義寡核苷酸能抑制SGC7901胃癌細(xì)胞的增殖，抑制率與時(shí)間濃度呈依賴關(guān)系。② survivin反義寡核苷酸對(duì)紫杉醇有增敏作用。③ survivin反義寡核苷酸下調(diào)survivin蛋白及