肝臟未分化胚胎性肉瘤的微衛(wèi)星雜合性缺失和miRNAs譜表達特征及其臨床病理學意義.pdf

1、[背景]
　　 1978年，Stocker和Ishak對美軍病理研究所(AFIP)收集到的一組31例具有肉瘤樣特征，并伴細胞質(zhì)內(nèi)PAS染色陽性小體的肝臟腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，51.6％的患者為6～10歲兒童，他們首次將其命名為肝臟未分化(胚胎性)肉瘤(undifferentiated(embryonal) sarcoma，UES)，現(xiàn)被世界衛(wèi)生組織(WHO)采用，也曾有人稱為肝臟惡性間葉瘤。UES是一種少見的，僅發(fā)生于肝臟的惡性間葉源

2、性腫瘤，免疫組化和電鏡結果支持UES是間葉細胞起源，有人推測可能來自間葉性錯構瘤惡變。至今全世界中英文文獻檢索僅報道約150例UES。UES惡性程度高，預后差，AFIP報道的UES患者的中位生存時間小于1年。到目前為止，UES多以個例臨床報道為主，還極少有單中心大例數(shù)UES組織發(fā)生和分子變異特點研究的報道。
　　 [目的]
　　 (1)探討單中心最大系列手術切除肝臟UES的臨床和病理學特點，為臨床和病理學正確診斷UES提

3、供組織病理學依據(jù)；
　　 (2)采用基因組微衛(wèi)星雜合性缺失(LOH)分析策略，探討UES的分子克隆起源特點，為了解UES的組織發(fā)生和分子分型提供分子病理學依據(jù)；
　　 (3)采用微小RNA(miRNAs)表達譜分析策略，篩選UES組織中高度差異表達miRNAs，通過生物信息學的方法預測其作用的靶基因，進而為開展UES靶基因功能通路和分子靶點的研究提供新的思路。
　　 [方法]
　　 (1)選取2000年1

4、月～2011年12月期間，在第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院行手術切除且臨床資料完整的43例UES患者，患者的性別、年齡、臨床癥狀等臨床參數(shù)來源于原始病歷記錄；UES的病理診斷按照WHO制定的標準，調(diào)閱全部UES病例的原始住院病歷、病理報告和組織切片，對腫瘤大小、組織結構、細胞類型及免疫組化結果等進行復片和核對。我們按照UES的組織學特點，將UES分成六個亞型：Ⅰ型：梭形細胞型、Ⅱ型：小細胞型、Ⅲ型：疏松水腫型、Ⅳ型：上皮樣細胞型、Ⅴ型：間

5、變細胞型、Ⅵ型：混合細胞型。通過電話和信件等方式隨訪患者的術后生存情況，隨訪時間截至到2011年12月30日。
　　 (2)根據(jù)我科實驗室建立的多結節(jié)性肝細胞癌和復發(fā)性肝細胞癌克隆起源特征微衛(wèi)星LOH檢測技術流程，選擇15個基因組微衛(wèi)星高頻LOH位點。又根據(jù)文獻報道，p53基因信號通路可能參與UES的發(fā)病機制，我們選取了該通路相關基因微衛(wèi)星D12S1972(CDK4)和D9S974(CDKN2A)2個微衛(wèi)星位點。此外，根據(jù)前期臨

6、床資料統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)UES在男性的發(fā)病率較高，為此，我們又選取了與雄激素受體(AR)基因相關的微衛(wèi)星DXS9736，共計18個微衛(wèi)星LOH檢測位點。以手術切除的18例含兩種成份且比例相當?shù)腢ES為微衛(wèi)星LOH研究對象，通過顯微切割技術分別獲取UES瘤組織和瘤旁肝組織，經(jīng)DNA抽提和微衛(wèi)星PCR-SSCP方法檢測，按照文獻共識，分別以微衛(wèi)星發(fā)生LOH差異位點的比例<30％和≥30％作為腫瘤單克隆(UO)和多克隆(MO)起源模式的診斷標準，

7、分析不同組織學類型UES在各微衛(wèi)星LOH位點的分布和發(fā)生頻率上的差異特點，同時，分析不同克隆起源的UES與臨床病理學特點及手術預后等參數(shù)的相關性。
　　 (3)提取8對UES石蠟包埋組織總RNA(UES瘤組織和瘤旁組織)，用miRNAs微陣列(包含1088個miRNAs)與總RNA雜交，使用Agilent G2655AA進行芯片掃描，F(xiàn)eature Extraction軟件讀取數(shù)據(jù)，采用Gene Spring軟件進行差異分析。在

8、2組樣本中篩選出比正常組織表達大于2倍或小于2倍差異表達的miRNAs，采用靶基因預測數(shù)據(jù)庫進行作用靶基因的預測和初步功能分析。
　　 [結果]
　　 (1)臨床病理學特點分析顯示：本組UES以中青年男性多見，平均年齡35±22.49歲，<14歲和≥15歲的UES患者分別占32.6％(14/43)和67.4％(29/43)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、右上腹不適、疼痛、及腹部包塊；血清學生化檢查以堿性磷酸

9、酶、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶升高多見，影像學檢查常出現(xiàn)大小不等囊狀影或不規(guī)則無回聲區(qū)。在三個年齡段中，14歲以內(nèi)的UES患者，男女發(fā)病比例為1:1，臨床常以腹痛和腹部包塊為首發(fā)癥狀，無乙肝病毒(HBV)感染史；而在15～49歲和≥50歲的UES患者中，男女發(fā)病比例分別為11:1和14:3，以男性多見，臨床癥狀不典型，成年男女UES患者均常伴有HBV感染史，分別為50％(6/12)和41.18％(7/17)。在UES的六個病理亞型中，梭形細

10、胞型(Ⅰ型)預后最好(中位生存時間為15±4.2月)，上皮樣細胞型(Ⅳ型)預后最差(中位生存時間為3.0±1.0月)(P=0.018)。
　　 (2)微衛(wèi)星LOH位點檢測結果顯示：MO型和UO型UES之間存在微衛(wèi)星LOH位點差異，多種瘤細胞成份的UES仍以UO型為主，占61.1％，MO型UES占38.9％。在所檢測的微衛(wèi)星位點中，D1S507、D4S402、D8S277和DXS97364個位點上存在不同LOH模式的比例均超過30

11、％，其中D8S277達到42.86％。UES克隆起源方式與患者的年齡和性別有關：MO型UES患者以<14歲的男性為主，UO型UES患者以≥15歲的女性為主(P=0.040,P=0.046)；MO型UES患者的術后中位無病生存期為18.0±2.6個月，明顯優(yōu)于UO型UES患者的11.0±3.1個月(P=0.019)。
　　 (3)miRNAs基因芯片檢測結果顯示：共有121個miRNAs在UES組織中出現(xiàn)差異表達，其中32個miR

12、NAs表達下調(diào)，89個miRNAs表達上調(diào)。挑選UES中下調(diào)最為顯著的miR-122、miR-192和miR-194作為靶基因預測對象，通過生物信息網(wǎng)絡平臺預測出miR-122、miR-192和miR-194的共同作用靶基因是NFAT5(參與Fyn，PKA，ATM和PI3K信號通路)和DYRK1A(調(diào)控CREB、STAT3、Gli等多種細胞內(nèi)信號轉導通路的關鍵蛋白激酶)。
　　 [結論]
　　 (1)我國UES患者的HB

13、V感染率達到30.2％，總體發(fā)病年齡較國外UES患者要晚5～10歲左右，提示我國UES好發(fā)于中青年男性，HBV感染可能是UES重要的病因學因素之一；微衛(wèi)星LOH檢測結果顯示，雄激素受體的LOH頻率達到36.4％，提示UES的發(fā)生還可能與雄激素代謝紊亂有關。
　　 (2)UES的病理亞型、微衛(wèi)星變異特點、克隆起源方式與手術預后相關。梭形細胞型UES患者的預后最好，上皮樣細胞型UES患者的預后最差；MO型UES患者的手術預后明顯優(yōu)于

14、UO型UES患者，而青少年UES患者多為MO型，中老年患者多為UO型，青少年UES患者術后無病生存時間優(yōu)于老年患者，表明對UES精細的病理分型和微衛(wèi)星LOH分子分型，可為臨床判斷預后提供有價值的參考依據(jù)。
　　 (3)UES的組織發(fā)生以UO起源為主。為此，我們有理由推測，UES有可能來源于肝組織內(nèi)多潛能腫瘤干細胞。而在MO型UES中，D1S507、D4S402、D8S277和DXS97364個位點的LOH發(fā)生頻率最高，有可能作為

15、鑒別MO型和UO型UES的分子病理學標志物；同時，這四個位點鄰近的基因分別為IBD7、USP53、DBA2和AR，為進一步研究UES發(fā)病機制中的基因通路提供了重要線索，而青少年和中老年UES的發(fā)病機制可能存在差異。
　　 (4)UES存在特異的miRNAs差異表達譜，其中miR-122、miR-192和miR-194三種miRNAs顯著下調(diào)，有可能作為UES新型腫瘤分子標志物，而對共同作用靶基因NFAT5和DYRK1A的深入研究