微衛(wèi)星雜合性缺失檢測多結節(jié)性和復發(fā)性肝細胞癌克隆起源及其臨床意義.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國是一種常見的惡性腫瘤。雖然手術治療明顯改善了肝細胞癌患者的預后，但總體上肝細胞癌術后5年生存率為40％左右，其中多結節(jié)性肝細胞癌和肝細胞癌術后復發(fā)是嚴重阻礙患者手術遠期療效的兩個重要瓶頸。了解多結節(jié)性和術后復發(fā)性肝細胞癌的生物學特性與治療模式和預后的關系，可以為臨床上更合理的個體化治療肝細胞癌提供有用的理論依據(jù)。 多結節(jié)性肝細胞癌和術后復發(fā)性肝細胞癌克隆

2、起源方式可分為肝內(nèi)轉移(intrahepatic metastasis，IM)和多中心發(fā)生(multicentric occurrence，MO)兩種情況，前者屬于單克隆起源，而后者為多克隆起源。判斷肝細胞癌克隆起源對于患者治療方案選擇以及評估預后十分必要。從理論上講，如果某個多結節(jié)性肝細胞癌為MO，那么各個結節(jié)的生物學行為與單發(fā)病灶的肝細胞癌相同，手術療效優(yōu)于肝內(nèi)轉移。但如果多結節(jié)病灶為IM，即肝內(nèi)的多個病灶為癌細胞在肝內(nèi)的擴散，由于

3、手術難以切除全部癌灶而可能導致手術治療效果不佳或失敗。同樣，復發(fā)性肝細胞癌的復發(fā)病灶既可能是IM，即術后復發(fā)的肝細胞癌來自術后肝內(nèi)殘留的病灶，也可能是MO，此類術后再次出現(xiàn)肝細胞的癌變，產(chǎn)生新的腫瘤，即第二次原發(fā)癌灶。 長期以來臨床上缺乏有效的標志物檢測肝細胞癌克隆起源。國內(nèi)外一些學者試圖從臨床病理學特點和分子生物學特性方面鑒別肝細胞癌的克隆起源，經(jīng)過多年的嘗試，學者們發(fā)現(xiàn)DNA倍體分析、p53基因突變差異位點分析、HBV-DN

4、A整合位點分析以及X染色體失活連鎖的HUMARA等檢測方法雖然各自均具有一定的優(yōu)勢，但是也都有明顯的缺欠。目前認為，肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的多階段、多步驟的演變過程，在這個過程中涉及到的一系列遺傳學改變(如癌基因的激活、抑癌基因的失活等)是其發(fā)生發(fā)展的分子基礎。包括肝細胞癌在內(nèi)的很多腫瘤存在基因或基因組不穩(wěn)定性或者遺傳不穩(wěn)定性。肝細胞癌中，發(fā)生在染色體1p，4q，5q，8p，8q，9p，10q，11p，13q，14q，16q

5、，17p和22q上的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)十分常見，提示緊密連鎖這些染色體區(qū)域上的相關抑癌基因在肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。多結節(jié)性和復發(fā)性肝細胞癌中不同結節(jié)之間出現(xiàn)不同LOH模式顯示它們由不同的腫瘤克隆組成，提示其多克隆起源和多發(fā)灶性發(fā)展。從技術上講，微衛(wèi)星LOH分析對于DNA含量少的標本，如針吸活檢或者肝組織活檢均適用，因此有助于在術前了解腫瘤的克隆來源。此外，對于福爾馬林固定石

6、蠟包埋的存檔肝細胞癌標本，在顯微組織切割基礎上亦可有效地提取基因組DNA進行LOH檢測。 研究目的： (1)選擇不同染色體上15個微衛(wèi)星位點對多結節(jié)性肝細胞癌和復發(fā)性肝細胞癌進行LOH分析，通過比較各腫瘤結節(jié)間LOH模式的異同，借此區(qū)分肝內(nèi)轉移和多中心發(fā)生； (2)建立一組具有較高MO檢出率的微衛(wèi)星位點檢測譜； (3)比較研究肝內(nèi)轉移和多中心發(fā)生肝細胞癌的臨床病理學特點，并進一步探討復發(fā)性肝細胞癌克隆起源

7、不同對預后的影響。 研究方法： 根據(jù)我科前期關于肝細胞癌基因組不穩(wěn)定以及小肝細胞癌微衛(wèi)星變異特點的相關研究結果，選擇7個高頻微衛(wèi)星LOH位點。此外，另選擇8個文獻報道的微衛(wèi)星LOH位點。以手術切除的40例復發(fā)性肝細胞癌和30例多結節(jié)性肝細胞癌為主要研究對象。首先根據(jù)癌結節(jié)的組織病理學對其克隆起源進行判斷。然后經(jīng)顯微切割技術分別獲取腫瘤和癌旁肝組織，經(jīng)DNA抽提和微衛(wèi)星PCR-SSCP檢測，分析腫瘤微衛(wèi)星LOH，比較多結節(jié)

8、性和復發(fā)性肝細胞癌中多個癌結節(jié)不同微衛(wèi)星位點LOH的差異，作為判斷肝細胞癌克隆起源的分子依據(jù)，并通過毛細管電泳測序驗證微衛(wèi)星PCR-SSCP檢測LOH的準確性。 結果： 判斷克隆起源的標準：對同一病例中不同腫瘤結節(jié)的15個微衛(wèi)星位點進行LOH分析，當信息性位點上各腫瘤結節(jié)LOH模式均相同，判斷為IM；當各腫瘤結節(jié)出現(xiàn)不同LOH模式的微衛(wèi)星位點數(shù)目/信息性位點總數(shù)大于30％，則判斷為MO；而小于30％則為無法判斷克隆起源(

9、UD)。 30例多結節(jié)性肝細胞癌中，15個微衛(wèi)星位點發(fā)生LOH的頻率從22.2％到56.9％，平均為36.7％。多結節(jié)性肝細胞癌中，33.3％(10/30)和60.0％(18/30)的患者分別診斷為MO以及IM，2例(6.7％)患者無法判斷克隆來源，形態(tài)學和PCR-SSCP檢測結果差異率為23.3％(7/30)。 40例復發(fā)性肝細胞癌病例中，15個微衛(wèi)星位點發(fā)生LOH的頻率從26.8％到46.9％，平均為37.5％。復發(fā)

10、性肝細胞癌中，30.0％(12/40)和65％(26/40)的患者分別診斷為MO和IM，2例(5％)患者無法判斷克隆來源，形態(tài)學和PCR-SSCP檢測結果差異率為22.5％(9/40)。 從上面2組研究對象中各隨機抽取4例配對樣本進行毛細管電泳測序，其結果與PCR-SSCP分析LOH的結果一致。 70例研究對象中，22例診斷為MO，其中有59.1％(13/22)均檢測到D4S402、D4S406位點LOH模式不同，此外D

11、17S831、D16S505、D17S938和D8S277這4個位點LOH模式不同占MO患者總數(shù)也均高于30％；而D8S258和D8S520位點則小于10％。剔除：D8S258即14個微衛(wèi)星位點即可將22位MO病例檢測出來。 將66例明確克隆起源的肝細胞癌分為MO和IM組，比較二組臨床病理指標的不同，結果發(fā)現(xiàn)二組在腫瘤大小、腫瘤是否侵犯血管、組織學分級和肝臟伴隨病變上有統(tǒng)計學差異。在復發(fā)性肝細胞癌中，MO和IM組至疾病進展時間分

12、別為(33.75±4.45)月和(14.23±2.54)月，MO組明顯長于IM組(P=0.001)。 結論： 1．選擇位于多條染色體(1，4，8，13，16和17)上的15個微衛(wèi)星位點，應用PCR-SSCP方法對多結節(jié)性和復發(fā)性肝細胞癌中不同腫瘤結節(jié)進行LOH分析，根據(jù)癌結節(jié)LOH模式的異同，可以在分子生物學水平上判斷多結節(jié)性肝細胞癌和復發(fā)性肝細胞癌的克隆起源。該方法是彌補組織形態(tài)學診斷不夠準確的理想方法之一。

13、2．聯(lián)合15個微衛(wèi)星位點與聯(lián)合14個位點(除外D8S258)在判斷肝細胞癌克隆起源上具有同樣的準確率。其中，在多中心發(fā)生肝細胞癌中檢出D4S402、D4S406、D17S831、D16S505、D17S938和D8S277位點上存在不同LOH模式的比例均超過30％，提示該6個位點更為敏感和特異，可以作為鑒別多中心發(fā)生肝細胞癌的首選位點。 3．對石蠟切片進行顯微切割獲取腫瘤組織DNA，結合PCR-SSCP技術進行LOH分析簡單、經(jīng)

14、濟、可行，且電泳條帶和毛細管電泳測序結果基本一致。 4．雖然組織學檢查不能作為判斷肝細胞癌克隆起源的主要依據(jù)，但在肝硬化基礎上，腫瘤體積較小，腫瘤無血管侵犯，組織學分化好、復發(fā)問期時間長與肝細胞癌多中心發(fā)生密切相關。將臨床病理學指標、組織形態(tài)學以及微衛(wèi)星LOH檢測相結合可以對多結節(jié)性和復發(fā)性肝細胞癌的克隆起源做出比較準確的判斷。 5．通過對復發(fā)性肝細胞癌生存分析發(fā)現(xiàn)，多中心發(fā)生的復發(fā)性肝細胞癌在第一次手術切除后至下一次肝