甘露聚糖結合凝集素調節(jié)THP1-CD14細胞細胞因子分泌機制的初步探索.pdf

1、盡管近年來天然免疫研究進展十分迅速，但是天然免疫的本質亟待揭示和闡明。隨著JanewayCAJr等提出天然免疫通過模式識別作用啟動獲得性免疫應答并左右其應答類型的假說，模式識別分子成為了免疫學的研究熱點之一。模式識別分子是天然免疫的重要分子，根據(jù)其存在的形式，可分為可溶性和細胞膜表面兩大類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，膜相模式識別受體中Toll樣受體家族(Toll-likereceptors，TLR)、巨噬細胞甘露糖受體(macrophagemannos

2、erecetor，MR)和可溶性模式識別分子中的膠凝素(collectins)家族成員肺表面活性物質脫輔基蛋白A和D(surfactantproteinA、surfactantproteinD，SP-A、SP-D)等是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。天然免疫模式識別作用正直逼免疫應答的核心問題--應答的啟動及其調控。 甘露聚糖結合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)與SP-A、SP-D同屬于膠凝素家族，主要

3、由肝細胞分泌，作為糖蛋白存在于血漿中。MBL的一級結構至高級結構均與補體分子C1q高度同源。MBL的主要功能區(qū)有二，即糖識別域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)和膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)。前者是識別功能區(qū)，能以Ca2+依賴方式識別多種病原體表面的糖結構。后者為效應功能區(qū)，與2個MBL相關絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP-

4、1，MASP-2)結合而激活補體凝集素途徑，在天然免疫中發(fā)揮防御作用，這是MBL作為補體成分的作用。近年來，對MBL的免疫調節(jié)作用亦有一些報道。國外相關研究表明，MBL，可抑制DC-SIGN介導的T細胞應答，調節(jié)外周血單個核細胞(peripheralbloodmonoeuclearcell，PBMC)分泌細胞因子。本課題組以前的工作也發(fā)現(xiàn)MBL具有免疫調節(jié)作用：能抑制LPS刺激DC功能的成熟，抑制LPS刺激不同分化和活化狀態(tài)的人單核細胞

5、系THP1／CD14細胞產生TNF-α和IL-12。然而，有關MBL免疫調節(jié)作用的機制，目前國內外尚未見相關報道。 本研究中，我們以人單核細胞系THP1／CD14為細胞模型，初步研究了MBL與THP1／CD14細胞的結合、結合的特性和MBL與TLR的相互作用。 一、MBL與人單核細胞系THP1／CD14細胞結合 采用Cell-ELISA和流式細胞術，對MBL是否與THP1／CD14細胞結合進行了研究。Cell-E

6、LISA結果顯示，MBL能以濃度依賴方式與THP1／CD14細胞結合。以流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在無Ca2+存在的或以EDTA取代CaCl2的結合緩沖液中，MBL與THP1／CD14細胞幾乎不結合；而在含5mmol／L或10mmol／LCaCl2的結合緩沖液中，MBL與THP1／CD14細胞可以結合，且在含10mmol／LCaCl2的結合緩沖液中結合能力比較強，提示二者的結合呈Ca2+濃度依賴關系。結果表明，從血漿天然MBL在生理條件下確實

7、可以結合THP1／CD14細胞，且這種結合具有Ca2+濃度依賴性，提示THP1／CD14細胞上可能存在MBL的受體或結合蛋白，且二者結合需要Ca2+參與。 二、MBL與THP1／CD14細胞結合特性的研究 一般認為，MBL可結合單核巨噬細胞表面的膠凝素受體即C1q受體(C1qrecepror，C1qR)。然而，根據(jù)上述結果，我們推測MBL可能通過其CRD與細胞表面某些糖蛋白或其他糖結構結合。本課題組已分段表達了重組人MB

8、L的CLR(rhMBL-CLR)和CRD(rhMBL-CRD)蛋白，建立了分泌抗人C1qR單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)的雜交瘤E8，為本部分的實驗提供了基礎。在本實驗中，我們首先制備了抗人C1qRmAbE8、rhMBL-CLR和rhMBL-CRD蛋白，然后采用流式細胞術對MBL結合THP1／CD14細胞的功能區(qū)進行了研究，檢測了多種糖、rhMBL-CRD、rhMBL-CLR、C1q和E8對THP1／CD14

9、細胞與MBL結合的抑制作用。結果顯示，THP1／CD14細胞與MBL的結合能被某些糖抑制；rhMBL-CRD、rhMBL-CLR蛋白單獨能部分抑制其結合，兩者聯(lián)合則可達完全抑制效果；但C1q和E8無抑制作用。資料表明，THP1／CD14細胞表達糖敏感的MBL受體或結合蛋白，包括對CLR和CRD特異的兩種受體，均與C1qR無關；MBL可能以一種以上的方式結合THP1／CD14細胞。 三、MBL與TLR關系的初步研究 TLR

10、-2是人類TLR家族成員中表達范圍最廣泛，識別病原微生物及其產物種類最多的分子，也是單核巨噬細胞主要表達的TLR之一。本部分研究中，我們首先采用ELISA、Westernblot對TLR-2能否直接與MBL結合進行了分析，結果表明MBL能直接結合真核表達的重組TLR-2胞外段蛋白。對LPS刺激THP1／CD14細胞結合MBL的情況進行研究，ELISA結果顯示，MBL與100ng／LLPS刺激的THP1／CD14細胞結合能力比無LPS刺激

11、者強，且sTLR-2蛋白可部分抑制這種結合;流式細胞術結果同樣表明，LPS刺激的THP1／CD14細胞的MBL結合能力增強，且具有LPS濃度依賴性，隨著LPS濃度增高，結合逐漸加強。然后，我們采用RT-PCR分析了LPS刺激對細胞TLR-2、TLR-4mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激2h后THP1／CD14細胞TLR-2、TLR-4mRNA表達水平增高；24h后有所下降，接近與未刺激時水平。最后，提取未刺激的、LPS刺激的和MBL加L

12、PS共同刺激的THP1／CD14細胞的核蛋白，采用Westernbolt方法分析和轉錄因子NF-KB的轉位，發(fā)現(xiàn)MBL可抑制LPS誘導NF-KB轉位，表明MBL調節(jié)細胞因子分泌的機制可能與抑制NF-kB轉位有關。 上述研究結果表明，THP1／CD14細胞表達Ca2+依賴性、糖敏感的MBL受體或結合蛋白，包括對CLR和CRD特異的兩種受體，均與C1qR無關。MBL可與TLR-2胞外段結合；LPS刺激后的THP1／CD14細胞結合M

13、BL能力增強，這與LPS刺激THP1／CD14細胞TLR-2和TLR-4的mRNA表達增高是一致的；MBL與THP1／CD14細胞的結合能被sTLR-2蛋白部分抑制；MBL可抑制LPS誘導THP1／CD14細胞核轉錄因子NF-kB的轉位。因此提出，MBL抑制LPS刺激THP1／CD14細胞產生促炎細胞因子可能與兩方面的機制有關：①THP1／CD14細胞在LPS刺激下TLR2和TLR4表達量增加，導致其與MBL的結合力增強、結合量增多；②