長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)超聲造影劑“脂氟顯”的制備優(yōu)化及評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景： 新型超聲造影劑的制備及應(yīng)用研究是近年來超聲醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。超聲造影劑是一種含有高濃度微氣泡的混懸液，與CT、MRI造影劑類似，超聲造影劑可以增強(qiáng)血流與周圍組織的回聲對(duì)比，明顯改善超聲影像對(duì)組織血流灌注的評(píng)價(jià)，顯著提高超聲診斷的敏感性和特異性，進(jìn)一步拓展超聲診斷領(lǐng)域，使超聲診斷由“平掃時(shí)代”進(jìn)入“增強(qiáng)時(shí)代”，被譽(yù)為超聲診斷領(lǐng)域的第三次革命。此外，超聲造影劑在超聲分子成像以及介入治療方面還有更大的應(yīng)用潛力，如：通過

2、在造影劑表面結(jié)合特異性配體制備靶向超聲造影劑；或利用超聲造影劑微泡攜帶基因或藥物，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移或藥物靶向治療等。為此，國外醫(yī)療機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，超聲造影劑不久將成為超聲診斷或治療中的常用試劑，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 超聲造影劑的發(fā)展經(jīng)歷了從空氣微泡到氟碳微泡、從白蛋白微泡到脂質(zhì)微泡的進(jìn)步，目前的發(fā)展趨勢(shì)是脂質(zhì)或多聚體作為成膜材料、亞微米級(jí)或納米級(jí)氟碳微泡、穩(wěn)定性好、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)。 我國在超聲造影劑的研究方面起步較晚、發(fā)

3、展較緩，因此，無論是技術(shù)、專利，還是市場(chǎng)，目前大部分被歐美公司所壟斷。在市場(chǎng)方面，目前國外已有多種產(chǎn)品上市，包括美國的Optison、Definity和Imageat，歐洲的SonoVue等；而國內(nèi)沒有自主上市的超聲造影劑，SonoVue是目前國內(nèi)唯一可以用于臨床的超聲造影劑，但價(jià)格昂貴，而且造影增強(qiáng)時(shí)間較短。 “脂氟顯”是我科自主研發(fā)的國內(nèi)第一個(gè)脂質(zhì)氟碳超聲造影劑。它是在國外新一代脂質(zhì)超聲造影劑的基礎(chǔ)上，通過對(duì)脂質(zhì)材料及制備工

4、藝進(jìn)行創(chuàng)新性改進(jìn)后研制成功的，具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“脂氟顯”具有微泡產(chǎn)出率高、使用劑量小、造影效果優(yōu)異、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，尤其在造影增強(qiáng)時(shí)間方面效果顯著，在肝、腎的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min以上，優(yōu)于國內(nèi)外多種超聲造影劑，具有很大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。但“脂氟顯”只是實(shí)驗(yàn)室的初試產(chǎn)品，很多工藝尚不成熟，表現(xiàn)為：工藝重現(xiàn)性較差，配方及制備工藝未優(yōu)化，工藝流程不完善等。此外，“脂氟顯”的聲學(xué)特性、應(yīng)用價(jià)值及方法學(xué)、應(yīng)用的安全性等

5、也有待進(jìn)一步研究。 研究目的： 1．對(duì)“脂氟顯”的配方、制備工藝進(jìn)行改進(jìn)、優(yōu)化和完善，以克服工藝重現(xiàn)性較差等不足，為其下一步商品化打下良好的基礎(chǔ)； 2．對(duì)改進(jìn)、優(yōu)化后的“脂氟顯”的理化性狀、聲學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)； 3．進(jìn)一步探討“脂氟顯”的應(yīng)用價(jià)值，包括常規(guī)增強(qiáng)顯像、靶向診斷和介入治療等方面。 4．對(duì)“脂氟顯”應(yīng)用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括作為靜脈注射藥物的安全性，以及與診斷超聲聯(lián)合作用的安全性等。

6、 主要方法及技術(shù)路線： 1．采用單因素分析或均勻設(shè)計(jì)等方法，對(duì)“脂氟顯”制備的各個(gè)環(huán)節(jié)逐一進(jìn)行考查，分析影響因素，分別進(jìn)行改進(jìn)、優(yōu)化和完善； 2．采用光鏡、透射電鏡、激光粒度分析儀和Coulter顆粒計(jì)數(shù)儀等對(duì)“脂氟顯”微泡的一般性狀、穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括微泡的形態(tài)、粒徑及分布、濃度、黏度、pH值、表面電位等； 3．采取穩(wěn)定性加速試驗(yàn)，對(duì)脂質(zhì)凍干粉劑的穩(wěn)定性進(jìn)行研究； 4．體外條件下，根據(jù)不同機(jī)械指數(shù)超

7、聲輻照前后“脂氟顯”造影圖像灰階值的變化，對(duì)微泡的耐壓性進(jìn)行研究； 5．采用低機(jī)械指數(shù)實(shí)時(shí)造影顯像技術(shù)，觀察“脂氟顯”對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常肝臟、心腔、心肌的造影增強(qiáng)效果以及肝、腎VX2腫瘤的診斷價(jià)值； 6．采用寬帶譜分析方法、Church模型方程等對(duì)“脂氟顯”微泡的粘彈特性和非線性特性進(jìn)行研究； 7．分別采用共價(jià)結(jié)合法和黏附法制備攜RGDS的靶向微泡造影劑，上述同樣方法對(duì)微泡的一般性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)后，采用熒光顯微鏡、流式細(xì)

8、胞儀對(duì)比觀察兩種方法所制備的靶向微泡RGDS的結(jié)合率及結(jié)合的牢固程度； 8．采用冷凍干燥法制備載紫杉醇的脂質(zhì)微泡造影劑，上述同樣方法對(duì)微泡的一般性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)后，采用熒光顯微鏡觀察紫杉醇與微泡是否結(jié)合、結(jié)合的部位，以反相高效液相色譜法(RP-HPLc)檢測(cè)紫杉醇的包封率； 9．通過急性毒性試驗(yàn)、靜脈用藥的溶血性、血管刺激性試驗(yàn)、熱原反應(yīng)以及血流動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)等，對(duì)“脂氟顯”作為藥物單獨(dú)應(yīng)用(即不合并超聲輻照)時(shí)的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)

9、； 10．以伊文思藍(lán)作為血管通透性改變的示蹤劑，并通過甲酰胺淬取出組織中伊文思藍(lán)，檢測(cè)其量的變化，以人體最敏感、也是最重要的心、腦血管作為研究對(duì)象，研究診斷超聲和“脂氟顯”聯(lián)合作用時(shí)對(duì)血腦屏障以及心肌血管通透性的影響； 11．以大鼠空間記憶能力的變化作為腦高級(jí)神經(jīng)功能改變的評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)“脂氟顯”和診斷超聲聯(lián)合作用開放血腦屏障后對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響。 主要結(jié)果及結(jié)論： 1．通過采用機(jī)械振蕩法取代超聲振蕩法

10、，改進(jìn)初次水合時(shí)脂質(zhì)混懸液的制備，優(yōu)化脂質(zhì)混懸液的凍干工藝，優(yōu)化配方等步驟，不僅使“脂氟顯”的制備流程更加簡(jiǎn)化、完善，工藝重現(xiàn)性明顯改善，而且微泡的性狀更加優(yōu)異。突出表現(xiàn)在：(1)微泡的產(chǎn)率明顯提高；(2)微泡的粒徑及粒徑分布更趨理想，從以往單純的微米級(jí)微泡變成含部分納米級(jí)微泡的亞微米級(jí)微泡；(3)微泡的耐壓性更好；(4)微泡的穩(wěn)定性增加；(5)微泡在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。 2．改進(jìn)、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡溶液的共振頻率在2.3

11、 MHz左右，估計(jì)微泡的粘彈特性為G<,S>=10MP<,a>,d<,Se>=0.1％R<,0>,μ<,S>=1.49N·S/m<'2>。此結(jié)果從理論上評(píng)價(jià)和解釋了“脂氟顯”微泡所表現(xiàn)出來的優(yōu)異理化性狀。 3．改進(jìn)、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡在一定聲壓激發(fā)下可以產(chǎn)生次諧波信號(hào)；次諧波的發(fā)展大致經(jīng)過三個(gè)階段：產(chǎn)生、增長(zhǎng)和飽和；在外加聲壓增大和減小的過程中，次諧波分量幅度曲線會(huì)出現(xiàn)回滯現(xiàn)象。“脂氟顯”微泡在一定聲壓激發(fā)下可以產(chǎn)生次諧波信號(hào)

12、的特性，預(yù)示著“脂氟顯”微泡在超聲成像以及超聲檢測(cè)方面有更好的應(yīng)用前景。 4．改進(jìn)、優(yōu)化后“脂氟顯”微泡能長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)犬心腔、心肌的灰階顯像，其中對(duì)心腔的目測(cè)增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間達(dá)1 h以上，是一種長(zhǎng)循環(huán)的亞微米級(jí)超聲造影劑；“脂氟顯”造影后，實(shí)驗(yàn)兔肝、腎VX2腫瘤的檢出率明顯提高，尤其提高了對(duì)肝、腎微小腫瘤的檢出能力；利用“脂氟顯”微泡可以結(jié)合特異性配體或攜帶藥物，在方法學(xué)上，采用共價(jià)結(jié)合法比黏附法可以大幅度提高微泡與特異性配體的結(jié)

13、合率以及結(jié)合的牢固程度。這些研究結(jié)果表明，“脂氟顯”不僅在常規(guī)增強(qiáng)顯像方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，而且在靶向診斷和介入治療方面有更大的應(yīng)用潛力。 5．大劑量“脂氟顯”微泡經(jīng)靜脈注射后對(duì)家兔紅血球無溶血和凝集作用，無任何血管刺激性及熱原反應(yīng)發(fā)生，對(duì)左心室壓、右心室壓、心率也無明顯影響；半數(shù)致死量測(cè)定試驗(yàn)中，注射劑量達(dá)常規(guī)使用劑量500倍時(shí)，小鼠也無一死亡，最大耐受量試驗(yàn)也未見明顯異常反應(yīng)和死亡，其毒性基本等同于生理鹽水，完全符合藥物安全性

14、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，安全閾值很寬，靜脈用藥十分安全。 6．采用“脂氟顯”進(jìn)行經(jīng)顱腦超聲造影時(shí)常規(guī)劑量注射，或心臟超聲造影檢查時(shí)常規(guī)劑量5倍的劑量注射，即使采用最高輸出強(qiáng)度的診斷超聲輻照10 min，也不導(dǎo)致大鼠血腦屏障或心肌血管通透性的任何改變。因此，應(yīng)用“脂氟顯”進(jìn)行常規(guī)造影檢查是非常安全的。 7．較大劑量“脂氟顯”造影劑注射結(jié)合較高機(jī)械指數(shù)的診斷超聲輻照可以可逆性的、選擇性的開放大鼠的血腦屏障，其對(duì)血腦屏障的開放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4