超聲聯(lián)合陽離子脂質(zhì)超聲造影劑介導(dǎo)Survivin-miRNA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　1.制備陽離子脂質(zhì)超聲造影劑（Cationic ultrasound contrast agent，C-UCA）和磁性脂質(zhì)超聲造影劑（Magnetic ultrasound contrast agent，M-UCA），并對(duì)其性能進(jìn)行驗(yàn)證；
　　2.運(yùn)用超聲聯(lián)合C-UCA方法轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pEGFP），探討C-UCA存在時(shí)的最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)；
　　3.將超聲、C-UCA與聚乙烯亞胺（Polyethe

2、rimide，PEI）相結(jié)合，探討三者協(xié)同增強(qiáng)Survivin-miRNA轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可行性。
　　方法：
　　1.通過機(jī)械振蕩法、薄膜水化-聲振法以及薄膜水化-機(jī)械振動(dòng)法制備具有陽離子性質(zhì)的C-UCA及M-UCA，對(duì)制備的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)C-UCA、M-UCA進(jìn)行理化性質(zhì)檢測(cè)、形貌表征及體外性能驗(yàn)證。選取較合適參數(shù)制備C-UCA，較優(yōu)的方法用于后續(xù)的基因遞送研究中。
　　2運(yùn)用已經(jīng)優(yōu)化的超聲參數(shù)，對(duì)

3、超聲聯(lián)合C-UCA轉(zhuǎn)染pEGFP時(shí)的C-UCA濃度、質(zhì)粒質(zhì)量、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基含血清與否和不同轉(zhuǎn)染方式等進(jìn)行優(yōu)化，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其中一組的轉(zhuǎn)染率，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活力，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染參數(shù)。
　　3.將超聲、C-UCA與PEI相結(jié)合介導(dǎo)Survivin-miRNA轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為6組：質(zhì)粒組（P組）、PEI+質(zhì)粒組（PEI+P組）、超聲+質(zhì)粒組（US+P組）、超聲+C-UC

4、A+質(zhì)粒組（UTMD+P組)、超聲+C-UCA+PEI+質(zhì)粒組（UTMD+PEI+P組）、空白組，通過倒置顯微鏡觀察不同處理方式對(duì)細(xì)胞的影響，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡率，CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力。
　　結(jié)果：
　　1. C-UCA、M-UCA的制備優(yōu)化及體外性能驗(yàn)證。
　　比較機(jī)械振蕩法、薄膜水化-聲振法和薄膜水化-機(jī)械振動(dòng)法制備 C-UCA，發(fā)現(xiàn)采用機(jī)械振蕩法和薄膜水化-機(jī)械振動(dòng)法制備的效能更高。與薄膜水化-聲振法

5、相比，二者制備的C-UCA濃度更高，粒徑更小，分布也更加均勻。采用最優(yōu)方法制備的 C-UCA粒徑＜1μm，濃度為1~10×109個(gè)/ml，分散性良好；將制備好的樣品室溫下放置4h，穩(wěn)定性良好，4℃條件下可延長至1個(gè)月。其中，陽離子脂質(zhì)含量為15％的C-UCA的基因攜載量最高可達(dá)70%。隨著C-UCA濃度的增加，Hela細(xì)胞生存率呈現(xiàn)一定的變化。當(dāng) C-UCA在20%濃度時(shí)其細(xì)胞活力為（88.6±3.4）%，與對(duì)照組和濃度為1%時(shí)比較，細(xì)

6、胞活力顯著降低（P＜0.05）。體外造影結(jié)果顯示，C-UCA回聲均質(zhì)，后方未見明顯衰減。將其稀釋2000倍后，仍可以見到較為細(xì)膩的回聲。
　　本研究還通過不同方法制備了M-UCA，其粒徑和濃度較C-UCA差，但分散性良好，其室溫下穩(wěn)定性同C-UCA。基因攜載量較C-UCA有所下降（27.65%）。M-UCA的濃度對(duì)Hela細(xì)胞的生存率也有一定的影響，隨著濃度的增加，Hela細(xì)胞生存率下降。當(dāng)M-UCA濃度為20%時(shí)，其細(xì)胞活力僅為

7、（59.81±7.56）%。體外造影結(jié)果顯示 M-UCA具有較好的體外造影能力。盡管如此，但是 M-UCA無論是在濃度、均一性、還是基因攜載率和細(xì)胞毒性方面，均比C-UCA相差較遠(yuǎn)，有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此，為了保證后續(xù)研究的順利進(jìn)行，本研究中選用了性能較好的C-UCA進(jìn)行轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化及凋亡實(shí)驗(yàn)的研究。
　　2.在前期優(yōu)化超聲參數(shù)（1MHz、20％DC、1W/cm2、1min）的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)的C-UCA濃度（5%）

8、、質(zhì)粒濃度（15μg）、細(xì)胞密度（1×106個(gè)/孔）、培養(yǎng)基（無血清）為最優(yōu)參數(shù)，用于以下的研究中。
　　3. PEI+P組和UTMD+P組可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，AI分別為39.4%、27.2%，顯著優(yōu)于其他各組（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果表明，PEI+P組與UTMD+P組時(shí)的Survivin mRNA抑制率明顯高于其他組的時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過轉(zhuǎn)染后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

9、＜0.05）。其中，UTMD+PEI+P組的細(xì)胞活力[（48.27±12.24）%]顯著低于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究采用機(jī)械振蕩法、薄膜水化-聲振法和薄膜水化-機(jī)械振動(dòng)法制備了C-UCA和M-UCA，并對(duì)其外形、粒徑及穩(wěn)定性基因攜載能力、細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)C-UCA更適用于聯(lián)合超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染研究中。此外，C-UCA和M-UCA都具有較好的回聲反射信號(hào)，為超聲造影劑提供了一種新