攜帶抗VEGF多克隆抗體、α-,v-β-,3-單克隆抗體脂質(zhì)微泡超聲造影劑的制備方法學(xué)研究.pdf

1、背景：隨著氟碳超聲造影劑的進一步成熟以及二次諧波顯像、反向脈沖諧波顯像等超聲造影技術(shù)的應(yīng)用，超聲造影能顯著改善影像對比分辨力，提高超聲診斷的敏感性和特異性，其價值已經(jīng)得到公認。人們開始著眼于將特異性配體連接到造影劑微泡表面，使它可以主動結(jié)合到感興趣的組織或者器官、選擇性的與相應(yīng)受體結(jié)合，從而達到靶向顯影和靶向治療的目的。文獻報道利用靶向微泡不但可能實現(xiàn)血栓、新生血管內(nèi)皮細胞、腫瘤組織靶向顯影，而且具有攜帶藥物、基因、甚至病毒實現(xiàn)靶向釋放

2、治療物質(zhì)，達到靶向治療的潛力[1-4]，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著對腫瘤發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)了一些與實體腫瘤生長過程密切相關(guān)或者與腫瘤細胞本身密切相關(guān)的一些特異性標記物。這些特異性標記物，一部分位于腫瘤新生滋養(yǎng)血管內(nèi)皮，接受促血管生成因子的作用，從而促進供應(yīng)腫瘤的滋養(yǎng)血管大量生成，以滿足腫瘤快速生長的需要。由于新生血管內(nèi)皮表達大量的血管生長因子受體和黏附分子家族受體，國外已有不少學(xué)者利用它們作為抗腫瘤血管生成的

3、靶向治療位點[5]。另一部分來源于腫瘤細胞，一些腫瘤細胞在生長、浸潤過程中分泌或者表達出某種特異性的腫瘤標記物逐漸明確。目前臨床已經(jīng)開始利用腫瘤和有關(guān)疾病的特異性抗原及其相關(guān)抗體的特異性，檢測血液中的腫瘤標記物，協(xié)助腫瘤的早期診斷。如果將腫瘤血管內(nèi)皮或者腫瘤細胞高表達的受體相對應(yīng)的配體結(jié)合在超聲造影劑微泡上，理論上講，就很可能實現(xiàn)腫瘤的靶向顯影和靶向治療。而實現(xiàn)上述設(shè)想的關(guān)鍵就在于靶向超聲造影劑的制備。盡管國外有關(guān)靶向超聲造影劑的研究報

4、道很多，然而如何制備靶向超聲造影劑大多闡述不詳，而且靶向超聲造影劑的制備技術(shù)是靶向研究的基礎(chǔ)，目前還處于探索改進階段，具有進一步探討的必要。 目的：本研究從腫瘤血管生成緊密相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和細胞間粘附分子整合素ανβ3入手，通過對本科實驗室自制的超聲造影劑“脂氟顯”的理化性質(zhì)的檢測，從理化性質(zhì)角度評價脂氟顯造影劑的安全性及在實質(zhì)器官增強顯影的長效性原因，并以此為基礎(chǔ)探討親腫瘤靶向微泡的制備方法，對靶向微泡的物理

5、性質(zhì)、穩(wěn)定性和對腫瘤細胞的體外尋靶能力作出初步評價。 方法：理化性質(zhì)評價：用OLYMPUSBX50(日本Olympus公司)光鏡分別在100倍、400倍光鏡下觀察脂質(zhì)造影劑脂氟顯微泡分布、大小、形態(tài)；用SysmexKX-21血球分析儀測定造影劑微泡濃度；ZetaSIZER3000電位儀測定PH值及表面電位；LBN6B型椎版式血流流變學(xué)測量儀測量造影劑黏度。 抗體與微泡的結(jié)合方法：將抗VEGF多克隆抗體稀釋，然后將超聲造影

6、劑與稀釋.的抗VEGF多克隆抗體等體積混合均勻，調(diào)整PH值在4～5之間，置入4℃冰箱，每30min振蕩一次，使其充分混合，孵育2h后液洗滌兩次。75μg抗ανβ3單克隆抗體，用同樣的方法使抗體與微泡結(jié)合。 微泡熒光標記方法：將一定量的熒光分子探針DiO溶于二甲基亞砜，按倍比稀釋法配制成不同濃度的DiO溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。并進行DiO溶液的涂片，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的亮度為“+++”時，得到最大稀釋倍數(shù)時DiO溶液的濃度，作為

7、標記脂質(zhì)造影劑的使用濃度[5]。脂質(zhì)微泡制備過程中加入一定量的DiO溶液經(jīng)超聲振蕩，或者在制備完成后加入一定量的DiO溶液經(jīng)機械振蕩后，靜置、冷卻15min，兩者均洗滌兩次，洗滌后涂片，在熒光顯微鏡下觀察標記微泡的熒光亮度。 靶向微泡熒光標記方法：用間接熒光抗體染色技術(shù)(雙層法)對靶向微泡進行熒光標記，即用攜帶熒光素的二抗標記與微泡結(jié)合的配體。具體而言將羅達明標記的二抗加入攜帶抗VEGF多克隆抗體的微泡，充分混合，調(diào)整PH值，在

8、室溫下孵育30min，最后再用PBS液洗滌兩次，用熒光顯微鏡觀察靶向微泡的熒光亮度。用普通光鏡觀察靶向超聲造影劑微泡濃度、分布、大小、形態(tài)；將熒光標記的靶向微泡分成兩部分，一部分連續(xù)洗滌四次以上后，即刻涂片觀察熒光亮度。另一部分置于4℃冰箱保存，分別于兩周、四周以后涂片觀察熒光亮度。 靶向微泡對腫瘤細胞的尋靶能力：培養(yǎng)ανβ3受體高表達的K1735M2黑色素瘤細胞，并用攜帶ανβ3的靶向超聲造影劑驗證其靶向性。 結(jié)果：1

9、.脂氟顯超聲造影劑微泡的粒徑范圍為3～10μm，其中98％在8μm以下，主要為4μm；微泡濃度(約)為7×109/ml左右(與保留下清液多少有關(guān))；PH值為6.42；生理鹽水稀釋25倍后，毛細管法測得造影劑黏度為0.75；在生理鹽水中，微泡表面電位為-35.5±4.0mv。脂膜包裹氟碳氣體、脂質(zhì)分子具有親水端與疏水端的分布特點(疏水端朝向氣體，親水端朝向液面)，有利于微泡保持良好的穩(wěn)定性，為靶向超聲造影劑的制備方法和熒光標記方法的選擇提

10、供了一定的依據(jù)。 2.采用靜電吸附方法能夠使抗體與微泡結(jié)合，靶向微泡在洗滌四次后仍可見明亮的熒光。靶向微泡分布均勻，大小沒有明顯的變化，濃度由109左右降到108左右。在4℃冰箱保存，一月以后仍然能觀察到“+++”的熒光。 3.用DiO通過機械振蕩方法和超聲振蕩方法均能標記普通脂質(zhì)微泡，激發(fā)出不同強度的綠色熒光，其中超聲振蕩法制成的綠色熒光微泡中心呈不透光綠色。羅達明標記的攜帶抗VEGF多克隆抗體的超聲微泡能在一定條件下

11、激發(fā)出中等強度的紅色熒光，而背景熒光相當微弱。 4.攜帶有ανβ3單克隆抗體的靶向微泡能較好的粘附在K1735M2黑色素瘤細胞表面，主要粘附于細胞體周邊，也部分粘附于細胞的突軸上，部分呈現(xiàn)典型的菊花團征，靶向微泡能較好的粘附在K1735M2黑色素瘤細胞表面，主要粘附于細胞體周邊，也部分粘附于細胞的突軸上。以黏附在細胞表面微泡數(shù)目大于4個以上作為靶向微泡黏附的結(jié)果，計數(shù)一個高倍鏡下的細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)90％以上的細胞都能達到靶向結(jié)合。而

12、使用普通微泡的對照組，結(jié)合在單個細胞上的微泡數(shù)目超過4個的細胞數(shù)為0％。 結(jié)論：1.本科實驗室制作的脂質(zhì)超聲造影劑“脂氟顯”的物理化學(xué)性質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)有潛在的生物有害作用，脂氟顯的組成及理化性質(zhì)是其穩(wěn)定性的物理基礎(chǔ)。在生理鹽水中微泡Zeta(表面)電位絕對值較大，可能利用靜電吸附方法制備靶向微泡。也可能利用DiO的單價陽離子和親脂端的特性通過靜電吸附標記脂質(zhì)微泡，為以后脂氟顯微泡及以此為基礎(chǔ)的靶向微泡的進一步研究打下基礎(chǔ)。

13、2.采用靜電吸附方法能夠?qū)⒖贵w與微泡結(jié)合，靶向微泡在主要理化性質(zhì)方面和普通微泡相似。靶向微泡具有一定的穩(wěn)定性。 3.用攜帶熒光素的二抗能較好標記靶向微泡，可觀察到靶向微泡被激發(fā)出紅色熒光。用熒光分子探針DiO可以有效標記普通對照微泡，超聲振蕩方法優(yōu)于機械振蕩方法。 4.攜帶抗VEGF和抗ανβ3抗體的靶向微泡均能在適當波長下激發(fā)出紅色熒光，間接證實了配體與微泡的結(jié)合。 5.體外親腫瘤細胞的尋靶試驗，驗證了攜帶αv