超聲造影劑——全氟丙烷脂質(zhì)微泡的制備與評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景:
　　 超聲造影劑（UltrasoundContrastAgents，UCAs）是一類(lèi)能夠顯著增強(qiáng)醫(yī)學(xué)超聲檢測(cè)信號(hào)的診斷藥物，是一種含有高濃度微氣泡的制劑。包裹氣體的微泡制劑具有強(qiáng)烈的超聲波散射性能，經(jīng)靜脈注射到達(dá)體內(nèi)各器官微循環(huán)后，可使超聲回波信號(hào)顯著增強(qiáng)，組織、器官圖像質(zhì)量顯著改善，從而大大提高超聲診斷效果。UCAs的出現(xiàn)顯著提高了超聲診斷的敏感性與特異性，進(jìn)一步拓展了超聲診斷領(lǐng)域，使超聲診斷由“平掃時(shí)代”進(jìn)入“增

2、強(qiáng)時(shí)代”，被譽(yù)為超聲診斷領(lǐng)域的第三次革命。更值得注意的是，對(duì)于某些診斷而言，它們將是幫助超聲有效競(jìng)爭(zhēng)MRI、CT的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　 新型UCAs的制備與應(yīng)用研究是近年來(lái)超聲醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)與前沿。UCAs的發(fā)展經(jīng)歷了從第1代包裹空氣的微泡制劑到第2代包裹氟碳類(lèi)惰性氣體的微泡制劑，造影劑在穩(wěn)定性和有效性方面均取得了突破性的進(jìn)展。目前，UCAs研制的重要發(fā)展方向是成膜材料的改進(jìn)，目的是使造影劑使用更安全、造影持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。從UCA

3、s研制的歷史看，九十年代初期研制的造影劑多采用人血白蛋白作為成膜材料，九十年代后期開(kāi)始向脂質(zhì)材料或多聚體材料方向發(fā)展。原因在于，從安全方面考慮，人血白蛋白作為血液制品存在傳播血液傳播性疾病的可能，安全性不如脂膜造影劑;從造影效果看，脂膜造影劑由大分子脂質(zhì)構(gòu)成的脂膜比變性白蛋白形成的膜更穩(wěn)定、更有彈性，造影效果更好，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更能滿足臨床的需要。因此，脂質(zhì)微泡的研發(fā)是目前UCAs發(fā)展的主流。
　　 UCAs市場(chǎng)是一個(gè)新興而蓬勃

4、發(fā)展的市場(chǎng)，國(guó)外已有的UCAs價(jià)格十分昂貴，因此，在國(guó)內(nèi)研發(fā)UCAs具有重要價(jià)值。歐美國(guó)家已經(jīng)先后開(kāi)發(fā)出新一代的脂質(zhì)UCAs，如SonoVue、Definity等，目前UCAs市場(chǎng)均被歐美國(guó)家所壟斷。國(guó)內(nèi)UCAs的研究以我科為先導(dǎo)，先后開(kāi)發(fā)出“東冠注射液”、“全氟顯”等以白蛋白為外殼的UCAs，其聲學(xué)活性在許多方面均優(yōu)于國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品。由于與人血白蛋白UCAs相比，脂質(zhì)UCAs存在著明顯的優(yōu)勢(shì)，所以后續(xù)開(kāi)發(fā)上市的造影劑都以脂質(zhì)UCAs為主

5、。因此，本課題組正致力進(jìn)行新型脂質(zhì)微泡UCAs的研究開(kāi)發(fā)工作，以填補(bǔ)國(guó)內(nèi)脂質(zhì)UCAs市場(chǎng)的空白。
　　 目的:
　　 1.對(duì)脂質(zhì)微泡UCAs的處方、制備工藝進(jìn)行改進(jìn)、優(yōu)化，以制備出高濃度、粒徑適宜、穩(wěn)定有效的脂質(zhì)微泡制劑，為脂質(zhì)UCAs的新藥研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 2.對(duì)脂質(zhì)微泡UCAs的理化性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括其外觀形態(tài)、濃度、粒徑、分布、內(nèi)含氣體全氟丙烷含量測(cè)定、耐壓穩(wěn)定性、以及液體制劑貯存穩(wěn)定性，以初步探索

6、脂質(zhì)UCAs的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3.進(jìn)一步探討脂質(zhì)微泡UCAs的動(dòng)物藥效學(xué)特性，對(duì)其在新西蘭大白兔肝和腎的顯影效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法:
　　 1.工藝參數(shù)及處方優(yōu)化研究
　　 1.1.工藝優(yōu)化
　　 采用高速剪切法制備脂質(zhì)微泡UCAs，單因素試驗(yàn)分析脂質(zhì)微泡的制備工藝參數(shù)，包括剪切速度、剪切時(shí)全氟丙烷氣體通氣時(shí)間、剪切時(shí)間。每個(gè)因素分別設(shè)不同水平，剪切速度（4檔、5檔、6檔）、剪切時(shí)全氟丙烷氣

7、體通氣時(shí)間(15s、30s、45s、60s)、剪切時(shí)間(90s、110s、120s、130s、150s)，以微泡的濃度、平均粒徑為指標(biāo)，通過(guò)方差分析優(yōu)選出最佳工藝參數(shù)。
　　 1.2.處方優(yōu)化
　　 采用優(yōu)選的剪切工藝參數(shù)，以混合磷脂為成膜材料，全氟丙烷氣體為內(nèi)核材料制備脂質(zhì)微泡。磷脂總濃度、DPPE-PEG5000的比例、DPPA的比例以及NaCl濃度是影響脂質(zhì)微泡濃度及粒徑的重要因素，因此，以磷脂總濃度(A)、DPP

8、E-PEG5000比例(B)、DPPA比例(C)、NaCl用量(D)作為自變量，以脂質(zhì)微泡的濃度作為因變量，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)L9(34)，篩選出脂質(zhì)微泡UCAs的最優(yōu)配方，為脂質(zhì)UCAs的新藥研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 2.脂質(zhì)微泡UCAs的理化特性評(píng)價(jià)
　　 2.1.微泡外觀形態(tài)觀察
　　 取脂質(zhì)微泡混懸液滴加于載玻片上，蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)。
　　 2.2.庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器檢測(cè)
　　

9、 采用50μm小孔管，0.9％NaCl電解液，分析體積500μl，粒徑測(cè)量范圍1.1μm～30μm。取微泡混懸液20μl，用生理鹽水稀釋5000倍，庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器測(cè)定微泡的濃度、平均粒徑及其粒徑分布。
　　 2.3.全氟丙烷氣體含量測(cè)定
　　 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定制劑中全氟丙烷氣體的含量。氣相色譜條件:色譜柱為DB-5ms(30m×250μm×0.25μm)，柱溫35℃，載氣為氦氣，柱流速為0.8ml/min。質(zhì)譜條件

10、:EI電離源，倍增電壓1900ev，選擇離子:m/z(質(zhì)荷比)69、169。樣品處理:分別精密吸取2ml微泡溶液，注入裝有500ml高純氮?dú)獾牟蓺獯鼉?nèi)，于超聲破碎儀上水浴超聲10min使微泡完全破裂釋放出OFP氣體。吸取50μl進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法算出氣體含量。
　　 2.4耐壓穩(wěn)定性
　　 用5ml注射器抽取4ml脂質(zhì)微泡混懸液，通過(guò)三通管連接eagle4000監(jiān)護(hù)儀，分別持續(xù)施加150mmHg、300mmH

11、g壓力1min、3min、5min、10min，再用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器測(cè)量其濃度、粒徑及分布。
　　 2.5.液體制劑貯存穩(wěn)定性
　　 制備脂質(zhì)微泡6批，于4℃±2℃冰箱保存，分別于第0月，1月、2月、3月、6月取樣品用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器分析其濃度、平均粒徑及分布，以研究液體微泡的貯存穩(wěn)定性。
　　 3.藥效學(xué)評(píng)價(jià)
　　 3.1.給藥劑量選擇
　　 取新西蘭大白兔3只，分別耳緣靜脈給藥0.005、0.01、0

12、.02、0.06、0.1ml/kg，分別進(jìn)行腎臟、肝臟超聲造影，隨機(jī)安排各劑量組的給藥次序，每個(gè)劑量組重復(fù)給藥測(cè)定5次，記錄圖像數(shù)據(jù)至造影效果出現(xiàn)明顯減退為止。采用儀器自帶的分析軟件Q-lab對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 3.2.造影效果評(píng)價(jià)
　　 取新西蘭大白兔3只，脂質(zhì)微泡UCAs給藥劑量為0.01ml/kg，分別進(jìn)行腎臟、肝臟超聲造影，每個(gè)臟器檢查重復(fù)3次，記錄圖像數(shù)據(jù)至造影圖像廓清為止。采用儀器自帶的分析軟件Q-lab

13、對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.按單因素試驗(yàn)考察脂質(zhì)微泡制備工藝相關(guān)參數(shù)，得出全氟丙烷脂質(zhì)微泡最佳的制備工藝參數(shù)為:剪切檔數(shù)6檔，通氣時(shí)間30s，剪切時(shí)間2min。
　　 2.按正交設(shè)計(jì)方法進(jìn)行制劑處方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出全氟丙烷脂質(zhì)微泡最佳制備處方:磷脂總濃度為1×10-3mol/L，DPPE-PEG5000比例為8％，DPPA比例為10％，NaCl用量為4.5mg/ml。
　　 3.按最優(yōu)工藝制備

14、的脂質(zhì)微泡混懸液為白色乳狀液，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)微泡呈透亮球形，分布均勻，彼此無(wú)聚集現(xiàn)象。微泡濃度為(2.99±0.19)×109個(gè)/ml，平均粒徑為(2.46±0.05)μm，97％微泡粒徑小于7μm，OFP含量為（387.81±35.28）μg/ml（每毫升脂質(zhì)微泡OFP含量）。
　　 4.微泡的耐壓穩(wěn)定性良好，耐受150mmHg壓力后，各時(shí)間組濃度并無(wú)顯著性差異(P＝0.051);耐受300mmHg壓力后在5min和10mi

15、n時(shí)與對(duì)照組（0min）相比濃度有顯著性差異(P＜0.001)，但濃度仍大于2×109個(gè)/ml，仍能滿足超聲顯影要求。
　　 5.對(duì)脂質(zhì)微泡混懸液進(jìn)行6個(gè)月的穩(wěn)定性考察，貯存于4±2℃冰箱中，在3個(gè)月內(nèi)微泡濃度、平均粒徑?jīng)]有顯著性變化（P均＞0.05）。第6個(gè)月時(shí)，微泡的濃度和粒徑都有所下降，與剛制備時(shí)（0月）相比差異顯著(P＜0.001)，但濃度仍大于2×109個(gè)/ml，平均粒徑也仍然滿足最佳粒徑要求。
　　 6藥效學(xué)

16、實(shí)驗(yàn)表明:脂質(zhì)微泡UCAs最佳給藥劑量為0.01ml/kg。脂質(zhì)微泡給藥劑量為0.01ml/kg時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)兔均獲得滿意的腎臟、肝臟聲學(xué)圖像，造影劑填充均勻，與周?chē)M織分界清晰。脂質(zhì)微泡腎臟造影時(shí)，其峰值減半時(shí)間為603±47s，廓清時(shí)間為726±6s;肝臟造影時(shí)其峰值減半時(shí)間為388±97s，廓清時(shí)間為718±89s，可以滿足臨床應(yīng)用要求。
　　 結(jié)論:
　　 1.用混合磷脂和全氟丙烷氣體作基本原料，經(jīng)高速剪切分散處理

17、水合磷脂可制備出直徑小于7μm、濃度大于2.0×109個(gè)/ml、穩(wěn)定性較好的全氟丙烷脂質(zhì)微泡。
　　 2.使用庫(kù)爾特顆粒分析儀測(cè)定脂質(zhì)微泡的濃度、粒徑及分布，方法簡(jiǎn)便可靠，是對(duì)脂質(zhì)微泡進(jìn)行質(zhì)量控制的主要手段。
　　 3.脂質(zhì)微泡中全氟丙烷氣體是其超聲顯影的主要成分，其含量是制劑質(zhì)控的關(guān)鍵指標(biāo)。氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定全氟丙烷氣體含量，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，可作為全氟丙烷類(lèi)UCAs的有效質(zhì)控手段。