骨形態(tài)發(fā)生蛋白7與肝纖維化相關(guān)研究.pdf

1、[目的]
　　 全球每年約有100萬人死于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。HBV感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭，肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟受到各種慢性損傷后發(fā)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)過多沉積，肝纖維化是個(gè)動(dòng)態(tài)過程，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。
　　

2、 肝星狀細(xì)胞(hepatic satellite cells，HSCs)的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其機(jī)制尚未明確。肝纖維化時(shí)HSCs的形態(tài)與功能發(fā)生了改變，大量增殖、合成以Ⅰ型、Ⅲ型膠原為主的多種ECM，同時(shí)合成、分泌組織金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)活性，從而抑制EC

3、M的降解。
　　 HSC的激活過程受許多因素調(diào)節(jié)，其中細(xì)胞因子起主要作用，而TGF-β/Smad途徑是最重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。拮抗TGF-β/Smad信號(hào)通路將不僅可能拮抗纖維化的進(jìn)程，還有可能減輕或修復(fù)肝臟炎癥損傷。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)是TGF-β超家族成員中最大的一族，是一種多功能、可溶性、局部分泌性蛋白，對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路具有拮抗作用。BMP-7是B

4、MPs家族的主要成員，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在多種疾病中具有顯著的抗纖維化、抗炎作用。
　　 BMP-7在肝纖維化過程中的作用機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)在慢性肝炎肝臟BMP7表達(dá)水平明顯增加，提示BMP-7可能促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)程，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)卻顯示外源性BMP-7還能對(duì)肝硬化小鼠模型有抗肝纖維化作用。
　　 本研究試圖通過研究慢性HBV感染者不同炎癥和纖維化分級(jí)肝組織中BMP-7的表達(dá)規(guī)律，以及通過重組BMP-7基因慢病毒載體

5、感染人肝星狀細(xì)胞株，并檢測(cè)其對(duì)人肝星狀細(xì)胞株產(chǎn)生ECM的影響，從臨床和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步闡明BMP-7在肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。
　　 [方法]
　　 一、通過對(duì)81例慢性乙型肝炎病毒感染者肝組織進(jìn)行常規(guī)病理、免疫組織化學(xué)及定量圖像分析，計(jì)算出BMP-7表達(dá)陽(yáng)性單位量，按照不同炎癥和纖維化分級(jí)分組，比較各組的差異，發(fā)現(xiàn)其中規(guī)律。
　　 二、從人骨肉瘤細(xì)胞株U-2中提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

6、，獲得BMP-7基因克隆，與真核表達(dá)載體pGC-FU Vector連接，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，行慢病毒包裝、濃縮獲得高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測(cè)定標(biāo)定病毒滴度。用重組BMP-7基因慢病毒載體感染人肝星狀細(xì)胞株，分別收集感染后4天和7天培養(yǎng)液上清，用ELISA檢測(cè)其中透明質(zhì)酸、三型前膠原、四型膠原和層粘蛋白的濃度，比較其與空白對(duì)照組、空病毒對(duì)照組的差別。
　　 [結(jié)果]
　　 一、慢性HBV感染者肝組織中BMP-7

7、的表達(dá)在隨著炎癥和纖維化嚴(yán)重程度的增加而增多；肝臟重度炎癥時(shí)，肝組織中BMP-7表達(dá)不因纖維化程度而變化；同樣肝臟重度纖維化時(shí)，肝組織中BMP-7表達(dá)不因炎癥程度變化。
　　 二、成功構(gòu)建BMP7重組真核表達(dá)載體，通過慢病毒包裝、收集和濃縮等得到滴度達(dá)到4x108TU/ml的重組慢病毒濃縮液。重組BMP-7基因慢病毒載體能感染人肝星狀細(xì)胞株，并成功表達(dá)。BMP-7重組慢病毒感染人肝星狀細(xì)胞株，第4天時(shí)上清中透明質(zhì)酸、三型前膠原、

8、四型膠原和層粘蛋白均與空白對(duì)照組、空病毒對(duì)照組無明顯差別，但第7天時(shí)上清中透明質(zhì)酸和四型膠原明顯低于對(duì)照組，三型前膠原和層粘蛋白則無明顯差別。
　　 [結(jié)論]
　　 1. BMP-7在慢性HBV感染者肝組織中的表達(dá)隨炎癥和纖維化嚴(yán)重程度的增加而增多，而在重度炎癥或重度纖維化時(shí)不再隨之變化，提示BMP-7在慢性肝炎肝纖維化發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用。
　　 2.重組BMP-7基因慢病毒感染能明顯減少人肝星狀細(xì)胞株產(chǎn)生