裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關(guān)病毒誘導(dǎo)成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展，臨床上創(chuàng)傷和骨病的患者日益增多，而隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的日新月異，很多以前治療困難的骨科疾病在現(xiàn)在都有了新的治療方法。但這也對(duì)骨科臨床方面的一個(gè)老問(wèn)題提出了新的要求，即“移植骨的來(lái)源”問(wèn)題。臨床上各類的骨病，如骨折不愈合，骨不連，脊柱融合，骨腫瘤切除后缺損的填充，多次關(guān)節(jié)置換后面臨的骨缺損等疾病，都需要正常，健康，缺乏免疫源性的骨組織，但如果此時(shí)患者本身無(wú)法提供這樣的骨組織，那么這類骨病的治療將如何處理？現(xiàn)階段患者自身的髂骨移植

2、仍是治療這類疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，患者自體的髂骨具有載體，含有骨誘導(dǎo)因子，骨生成細(xì)胞的三大基本成骨的要素。但同時(shí)也存在著取骨部位的并發(fā)癥，如出血，感染，延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間等不利因素。而同種異體骨應(yīng)用的明顯不利因素是價(jià)格昂貴，具有免疫源性以及傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　目前腺病毒相關(guān)病毒（Adeno-associated virus,AAV）顆粒是現(xiàn)在國(guó)際上公認(rèn)的最具有臨床安全性的病毒載體。和傳統(tǒng)的腺病毒（Adenovirus,AV）不同，腺病毒相關(guān)病

3、毒可以高效定點(diǎn)整合至人染色體中，避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，對(duì)人類健康沒(méi)有危害性，目前在美國(guó)應(yīng)用于臨床試驗(yàn)研究。AAV具有病毒顆粒小，轉(zhuǎn)染率高，免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)分裂或不分裂的細(xì)胞都有很高的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）具有誘導(dǎo)體內(nèi)干

4、細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的能力。當(dāng) BMPs基因被裝載到病毒載體上，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的過(guò)程可結(jié)合入細(xì)胞的基因組中，通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯而合成相應(yīng) BMPs蛋白分泌到細(xì)胞外。分泌到細(xì)胞外的蛋白通過(guò)作用于自身或周圍的干細(xì)胞而誘導(dǎo)其向成軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)證明構(gòu)建的AAV-BMP4具有良好的生物學(xué)活性。對(duì)異位骨組織形成過(guò)程的組織學(xué)分析證實(shí)該過(guò)程是通過(guò)軟骨化骨的方式誘導(dǎo)生成的。
　　骨組織工程中三個(gè)基本要素分別是細(xì)胞，生長(zhǎng)因子

5、和載體。而現(xiàn)在常用的載體分別有羥基磷灰石（Hydroxyapatitie，HA）,脫鈣骨基質(zhì)（Decalcified Bone Matrix，DBM）。羥基磷灰石是人體骨骼組織的主要無(wú)機(jī)組成成分，具有一定的硬度，表面多孔性，適于細(xì)胞的吸附，具有骨傳導(dǎo)性，但是不具備骨誘導(dǎo)性。脫鈣骨基質(zhì)由同種異體骨或異種骨經(jīng)脫鈣處理，能降低免疫原性的骨移植材料，主要成分為含有多種活性骨誘導(dǎo)因子的I型膠原成分，具有骨誘導(dǎo)性。包裝有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺相關(guān)病毒

6、（AAV-BMP4）吸附在Gelfoam膠原上后形成的復(fù)合物具有明顯的骨誘導(dǎo)性。當(dāng)復(fù)合物被植入體內(nèi)之后，Gelfoam上吸附的AAV-BMP4顆粒可轉(zhuǎn)染骨骼肌肉內(nèi)的細(xì)胞，誘導(dǎo)新生骨組織的形成，具有明顯的骨誘導(dǎo)性。
　　本課題包括以下三部分：
　　1.裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關(guān)病毒的構(gòu)建及其活性測(cè)定；
　　2.裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關(guān)病毒的體內(nèi)成骨研究；
　　3.誘導(dǎo)生成的骨組織治療顱骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研

7、究。
　　第一部分裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關(guān)病毒的構(gòu)建及其活性測(cè)定
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是將BMP4基因構(gòu)建入AAV載體內(nèi)，通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞裂解，高速氯化銫梯度離心的方法純化出AAV-BMP4。并通過(guò)體外DNA dot-blot雜交的方式來(lái)確定其濃度。待AAV-BMP4的純化和濃度測(cè)定結(jié)束之后，將AAV-BMP4吸附于Gelfoam上并植入SCID小鼠的股肌袋內(nèi)進(jìn)行AAV-BMP4的活性測(cè)定。結(jié)

8、果顯示通過(guò)上述方法，可有效地構(gòu)建出純化后濃度達(dá)5×1012 vp/ml的AAV-BMP4病毒顆粒。純化后的AAV-BMP4病毒顆粒植入小鼠的股肌袋內(nèi)可成功誘導(dǎo)異位骨組織的形成，證明了本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的AAV-BMP4具有良好的生物學(xué)活性。對(duì)異位骨組織形成過(guò)程的組織學(xué)分析證實(shí)該過(guò)程是通過(guò)軟骨化骨的方式誘導(dǎo)生成的。
　　第二部分裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關(guān)病毒的體內(nèi)成骨研究
　　本次進(jìn)一步的研究是通過(guò)多種方法來(lái)探討在小鼠背部皮下應(yīng)

9、用AAV-BMP4復(fù)合骨骼肌肉誘導(dǎo)異位成骨的可能性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用了兩種方法，一是應(yīng)用整塊狀肌肉復(fù)合AAV-BMP4+Gelfoam，并將該復(fù)合物植入小鼠背部皮下來(lái)研究復(fù)合物的成骨能力的。二是將切碎后的骨骼肌肉預(yù)先移植入到小鼠的背部皮下，間隔特定時(shí)間后再在該部位植入 AAV-BMP4+Gelfoam復(fù)合物來(lái)研究這種方法在小鼠皮下的成骨能力。三組植入物在手術(shù)后的4，8,12周時(shí)接受X線檢查，結(jié)果示 HA/TCP組皮下和股肌袋中持續(xù)見(jiàn)明顯的高

10、信號(hào)影，DBM組未見(jiàn)明顯的高信號(hào)影，AAV-BMP4組三個(gè)時(shí)間段只在股肌袋可見(jiàn)高信號(hào)影。H.E和Von Kossa染色證實(shí)DBM組和AAV-BMP4組在小鼠的股肌袋中有新生骨形成，但小鼠的皮下部位未見(jiàn)明顯的新生骨形成。HA/TCP組未見(jiàn)明顯的新生骨組織形成；整塊骨骼肌肉包裹的AAV-BMP4+Gelfoam復(fù)合體在小鼠的背部皮下沒(méi)有誘發(fā)出明顯的骨組織形成。X線和microCT的檢查均證實(shí)了小鼠的背部皮下無(wú)明顯高信號(hào)影。組織學(xué)結(jié)果觀察顯示

11、植入小鼠背部皮下的骨骼肌肌纖維中未見(jiàn)到新生血管的長(zhǎng)入，而骨骼肌肌細(xì)胞出現(xiàn)了壞死的表現(xiàn)；切碎后的骨骼肌肉預(yù)先植入小鼠的背部皮下4周后，在此基礎(chǔ)上重新植入的AAV-BMP4+Gelfoam復(fù)合體后4周出現(xiàn)了少量的新生骨組織。X線和microCT的檢查均證實(shí)了小鼠的背部皮下出現(xiàn)少量的高信號(hào)影，組織學(xué)觀察也可見(jiàn)少量的骨組織形成。
　　第三部分誘導(dǎo)生成的骨組織治療顱骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　利用AAV-BMP4容易轉(zhuǎn)染體內(nèi)骨骼肌細(xì)胞的特

12、性，然后誘導(dǎo)骨骼肌肌肉通過(guò)軟骨化骨的方法形成大量的骨組織。然后等待骨組織形成穩(wěn)定之后，取出這些骨組織移植入事先制備好的顱骨缺損的動(dòng)物模型體內(nèi)，用來(lái)修復(fù)小鼠的顱骨缺損。這種方法和干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療方法相比，省卻了干細(xì)胞的分離，體外培養(yǎng)，體外病毒的轉(zhuǎn)染，細(xì)胞復(fù)合載體等步驟，節(jié)約了時(shí)間，而且最重要的特點(diǎn)是需要成骨的部位不會(huì)出現(xiàn)骨組織的異常增多。該研究的方法包括體外應(yīng)用Gelfoam吸附AAV-BMP4病毒形成復(fù)合物，并將該復(fù)合物移植入小鼠

13、的股部骨骼肌肌袋內(nèi)。在誘導(dǎo)骨骼肌成骨后12周時(shí)，建立小鼠顱骨缺損模型，通過(guò)手術(shù)的方法取出AAV-BMP4誘導(dǎo)的異位形成的骨組織，并將其移植至新建小鼠的顱骨缺損處。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，經(jīng)修剪移植入小鼠顱骨缺損模型處的骨組織在植入缺損處后，沒(méi)有出現(xiàn)異常增生的現(xiàn)象，而是不斷地隨著時(shí)間的推移進(jìn)行著外形的輕微改建，與宿主的骨組織結(jié)合良好。移植骨的外部毛刺逐漸消失，CT三維重建所示的移植骨表面的微小空洞逐漸融合消失,移植骨與宿主顱骨缺損的骨組織邊緣融

14、合良好，該顱骨缺損得到了良好的修復(fù)。
　　結(jié)論
　　1.體外構(gòu)建的AAV-BMP4具有良好的生物學(xué)活性。植入骨骼肌內(nèi)后可誘導(dǎo)形成新生的骨組織，組織學(xué)分析證實(shí)該過(guò)程是通過(guò)軟骨化骨的方式誘導(dǎo)生成的。
　　2.三組植入物中 AAV-BMP4+Gelfoam在骨骼肌肉誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)，DBM其次，而HA則缺乏誘導(dǎo)成骨的能力。在小鼠的皮下部位，三種植入物都不具備誘導(dǎo)成骨的能力。整片肌肉包裹AAV-BMP4+Gelfoam的復(fù)合體