小麥葉片中潛伏侵染白粉菌的Nested PCR檢測.pdf

1、小麥白粉病是小麥生產上的主要病害之一,病害流行的預測預報和風險估計是綜合防治的重要部分.盡早、準確地估計病害發(fā)生趨勢是有效的預測預報的關鍵.雖然我國小麥白粉病發(fā)生規(guī)律因地區(qū)和氣候條件而異,但對越冬麥苗和越夏自生麥苗的潛育侵染程度做及時、準確的監(jiān)測成為不同地區(qū)病害預測預報和風險估計中普遍存在的關鍵環(huán)節(jié).而這方面的進展受到傳統(tǒng)、落后方法的制約,如葉片或幼苗取樣培養(yǎng)的方法耽工、費時、靈敏性差.快速發(fā)展的分子生物學技術顯示了有效改進流行學方法的

2、巨大潛力.本研究應用分子生物學原理、技術和方法探討準確、快速地測定小麥白粉病潛育侵染的新方法,為改進流行學的傳統(tǒng)監(jiān)測方法奠定了基礎. 本研究根據小麥白粉菌 (Blumeria graminis f.sp.tritici) 核糖體內轉錄間隔區(qū) (ITS) 序列設計合成常規(guī)PCR 引物F1/R1、F2/R1、F3/R1.應用小麥其它病原真菌做參照,表明所設計的三對引物均對小麥白粉菌有特異性,能區(qū)分小麥白粉菌和其它麥類病害.其中F1/

3、R1較F2/R1、F3/R1靈敏性更高,可檢測到1pg白粉菌DNA.在篩選獲得的特異性引物F1/R1所擴增產物的序列基礎上,設計合成了Nested-PCR 內外引物,并對其進行靈敏性測定.應用所設計的Nested-PCR流程,從純培養(yǎng)的病原菌中可檢測到的最低病菌DNA含量為0.1fg. 本研究建立了從小麥病葉中提取白粉菌DNA的技術.應用常規(guī)PCR和Nested PCR對室內用不同接種量人工接種白粉菌后在不同潛育侵染階段取樣的小

4、麥葉片做病原菌的PCR測定分析.用最低接種量300個孢子/cm<'2>時,采用常規(guī)PCR能從接種3d后的小麥葉片中檢測到白粉菌DNA,而用Nested-PCR能從接種1d后的小麥葉片中檢測到潛伏侵染的白粉菌.在人工接種的條件下Nested PCR比常規(guī)PCR對檢測相同程度的潛伏侵染至少提前2-3d.在潛育侵染早期和接種濃度低時,Nested PCR 比常規(guī) PCR 在檢測效果上有明顯優(yōu)勢. 從北京和山東兩地的秋苗上,共選取11個

5、采樣點對人工接種小麥白粉菌或自然侵染的葉片取樣,用常規(guī) PCR 和 Nested-PCR 對未顯癥葉片的檢測結果表明,常規(guī)PCR測定的葉片侵染率對葉片離體培養(yǎng)測得的侵染率的直線回歸預測式只在0.05水平上顯著(r<'2>=0.49,P=0.0163),有6個樣點未測到侵染病葉.而Nested PCR測定的葉片侵染率與葉片離體培養(yǎng)測得的侵染率的直線回歸式極顯著(r<'2>=0.66,P=0.0023).此結果表明,Nested PCR方法