RhoA參與IL-8誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移的分子機理研究.pdf

1、研究背景:遷移活動(Migration)是活細胞普遍存在的一種運動方式。血管內(nèi)皮細胞(ECs)的遷移在血管生理、病理活動中扮演極為重要的角色。臨床觀察證明，血管外科手術(shù)后的傷口愈合、內(nèi)皮損傷區(qū)的再內(nèi)皮細胞化(Reendothelization)都伴隨著內(nèi)皮細胞向傷口處的遷移。內(nèi)皮細胞遷移在血管重建(Remodeling)過程中起著重要作用。例如組織再生過程中的血管生成(Angiogensis)，血管旁路移植、氣囊血管形成術(shù)(Balloo

2、n angioplasty)后的傷口愈合都必須有內(nèi)皮細胞從鄰近部位遷移到損傷部位。而在一些慢性疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化和慢性炎癥纖維化等也常伴有特定的細胞遷移。惡性腫瘤侵襲周圍組織的過程中，也常常伴隨著血管內(nèi)皮細胞的遷移，在腫瘤實體中形成豐富的新生血管來對腫瘤細胞增殖提供足夠營養(yǎng)。血管新生是在生理或者病理情況下，在原有血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，從先前存在的血管處以芽生或者非芽生的形式形成新的血管的過程，該過程主要分為血管

3、內(nèi)皮細胞增殖、遷移、管腔形成三個步驟。其中，血管內(nèi)皮細胞的遷移是血管新生過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在生理、病理過程中促使血管內(nèi)皮細胞遷移的誘導(dǎo)因素有很多。IL-8是1987年由Yoshimura等首次從脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)及植物血凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)刺激的人血單核細胞培養(yǎng)上清中純化出的一種CXC家族趨化因子<'[5]>，主要是由單核．吞噬細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，是很多誘導(dǎo)炎性細胞趨化

4、性活動中非常重要的一種信號分子，參與多種非特異性炎癥的病理發(fā)生過程。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化或內(nèi)皮細胞損傷部位都有IL-8的高表達，IL-8也能夠激活內(nèi)皮細胞，因此認為IL-8參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展全過程，在這當(dāng)中起著介導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的作用。 近年來，細胞遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究逐漸成為熱點。許多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，細胞遷移的主要過程為細胞外部信號引起細胞的極化，從而使細胞沿移動方向形成突觸，細胞的突觸與基底形成黏附，這些黏附

5、作為細胞收縮的支點，當(dāng)細胞收縮時細胞整體向前移動，細胞尾部與基底的黏附點得以釋放。而這一過程中主要涉及到細胞骨架和細胞黏附相關(guān)的動態(tài)組裝和空間位置的改變。小G蛋白RhoA家族是肌動蛋白細胞骨架重新組裝的主要調(diào)節(jié)因子之一，因此在協(xié)調(diào)細胞遷移中起著重要作用。此外，在對整合素信號通路研究中發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)不斷提供信號給遷移細胞的RhoA蛋白，從而影響細胞遷移。另有研究表明，長期抑制RhoA激酶活力可以誘導(dǎo)冠狀動脈粥樣硬化斑塊的消退。由此可見，Rho

6、A蛋白可能是介導(dǎo)IL-8誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移中的關(guān)鍵分子之一。 本研究的目的在于探討IL-8這一趨化性細胞因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的機理，并在前期實驗的基礎(chǔ)上進一步觀察RhoA蛋白對于內(nèi)皮細胞遷移的作用，以期揭示惡性腫瘤血管新生的相關(guān)細胞分子機制，為惡性腫瘤的診斷與防治提供新思路。 研究方法:選用本實驗室保存的內(nèi)皮細胞株EA.hy 926作為靶細胞，研究方法如下： 1．選用濃度為0、50ng/ml、100 ng/ml、

7、200 ng/ml的IL-8分別加入Transwell小室下層，誘導(dǎo)上層的內(nèi)皮細胞遷移，4h后，對遷移至下層的內(nèi)皮細胞進行計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析，以選擇最適的IL-8濃度，為后期實驗提供準(zhǔn)備。 2．采用脂質(zhì)體包繞法將RhoA野生型、主導(dǎo)抑制型RhoA188A和穩(wěn)定表達持續(xù)活化型RhoA63L突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入血管內(nèi)皮細胞后，使用G418穩(wěn)定篩選得到穩(wěn)定表達的細胞株。 3．對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株進行分析，RT-PCR檢查其mRNA，

8、Western-blot檢查蛋白翻譯情況，Pull-down檢查活性蛋白表達情況。 4．實驗分為4組：RhoAwt組、RhoA188A組、RhoA63L組和對照組加入Transwell小室上層，下層加入IL-8，在4h后，對遷移至下層的內(nèi)皮細胞進行計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果: 1．當(dāng)IL-8濃度為100 ng/ml時內(nèi)皮細胞遷移率最大，因此我們將選擇100 ng/ml的IL-8進行實驗。 2．培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細

9、胞株：RhoAwt、RhoA188A、RhoA63L成功。 3．對于轉(zhuǎn)染情況的檢查，RT-PCR檢查其mRNA，Western-blot檢查蛋白翻譯情況，Pull-down檢查活性蛋白表達情況均獲得理想結(jié)果。 4．在IL-8刺激下，EA．hy926-Rh063L組細胞遷移能力遠較對照組高，而EA.hy926-Rh0188A組細胞遷移能力則被明顯抑制。 結(jié)論: 1．IL-8作為一種新型的細胞趨化因子，不僅能