低雄激素誘導(dǎo)雄性大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、背景：近年來(lái)，雄激素與心血管疾病間的關(guān)系日益受到重視，在臨床研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分心血管疾病高發(fā)的中老年男子的雄激素處于低水平狀態(tài)。雄激素不足與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而且已有報(bào)道，低雄激素水平是血管內(nèi)皮功能失調(diào)的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。致病因子可以通過(guò)多種途徑損傷血管內(nèi)皮，其中內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。許多促動(dòng)脈粥樣硬化因子都可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步引起一系病理生理反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的心血管

2、疾病。雄激素缺乏作為一種心血管危險(xiǎn)因素是否也增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡值得進(jìn)一步研究。因此本研究通過(guò)建立低雄激素大鼠模型，初步探討雄激素缺乏對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。本研究分為五個(gè)部分：
　　 第一部分：低雄激素大鼠模型的建立。
　　 目的：采用大鼠雙側(cè)睪丸切除術(shù)，建立低雄激素大鼠模型，并檢測(cè)模型是否成功。
　　 方法：18 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為三組(n=6)，對(duì)照組，給予假去勢(shì)；去勢(shì)組，施行去勢(shì)手術(shù)，建成低雄激素模型

3、；替代組，施行去勢(shì)手術(shù)后，給予肌肉注射睪酮（十一酸睪酮50mg/Kg/月）替代治療；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采血測(cè)睪酮水平。
　　 結(jié)果：而實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)去勢(shì)組大鼠血清睪酮水平顯著低于其他兩組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：采用大鼠雙側(cè)睪丸切除術(shù)，可以建立低雄激素模型，且具有較好的穩(wěn)定性。
　　 第二部分：去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮及其線粒體病理改變。
　　 目的：觀察大鼠主動(dòng)脈大體結(jié)構(gòu)及其內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 方法：建

4、模成功10 周末，固定麻醉大鼠，分離腹主動(dòng)脈，取一段4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，部分蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組大鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的病理改變；另取一段2.5％戊二醛固定，透射電鏡觀察血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：HE 染色結(jié)果示，三組大鼠中，對(duì)照組主動(dòng)脈肌層平滑肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，內(nèi)膜光滑完整，薄厚均一，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，去勢(shì)組主動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)結(jié)構(gòu)排列紊亂，內(nèi)膜下細(xì)胞增生明顯；替代組動(dòng)脈內(nèi)膜病變明顯較去勢(shì)組減輕。

5、透射電鏡觀察，對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平，結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，高倍鏡下線粒體形態(tài)、大小均勻，嵴清晰。去勢(shì)組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，變性，突起或脫落，染色質(zhì)凝集，線粒體皺縮，數(shù)量減少，嵴溶解。給予雄激素替代治療后其主動(dòng)脈內(nèi)皮病變較去勢(shì)組明顯減輕。
　　 結(jié)論：去勢(shì)后大鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)破壞明顯，內(nèi)皮細(xì)胞染色質(zhì)凝集，線粒體皺縮，數(shù)量減少，嵴斷裂，溶解。
　　 第三部分：內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的變化及凋亡情況分析。
　　

6、目的：觀察三組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。
　　 方法：采用密度差速離心方法提取內(nèi)皮細(xì)胞線粒體，向提取的線粒體中加入儲(chǔ)存液制備成純化線粒體提取物，將陽(yáng)離子熒光羰花青染料加入純化線粒體制備物中暗室孵育10min，后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性；同時(shí)取一段主動(dòng)脈標(biāo)本，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，采用TUNEL 法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。
　　

7、 結(jié)果：與對(duì)照組和替代組相比，去勢(shì)組大鼠純化線粒體熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱，內(nèi)膜功能受損TUNEL 檢測(cè)結(jié)果示與其他兩組相比，去勢(shì)后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多（P<0.05）。
　　 結(jié)論：去勢(shì)組大鼠血管內(nèi)皮線粒體膜電位降低，內(nèi)膜功能受到損害，細(xì)胞凋亡增多。
　　 第四部分：線粒體凋亡途徑相關(guān)因子在血管內(nèi)皮表達(dá)情況。
　　 目的：觀察三組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡途徑中相關(guān)因子的表達(dá)情況。
　　 方

8、法：采用real time RT-PCR 技術(shù)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞bcl-2、caspase-9 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平；免疫組化方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞色素C(Cytochrome c Cyt C), caspase-9 和caspase-3 蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，去勢(shì)組內(nèi)皮細(xì)胞bcl-2 表達(dá)減少，而Cyt C，caspase-9和caspase-3 表達(dá)顯著增高(P<0.05)，替代組與對(duì)照組間均

9、無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：雄性大鼠體內(nèi)雄激素缺乏時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡抑制因子表達(dá)下調(diào)，而凋亡相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)。
　　 第五部分：內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及胞內(nèi)游離鈣離子濃度測(cè)定。
　　 目的：體外培養(yǎng)去勢(shì)后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)第二信使游離鈣離子濃度改變。
　　 方法：建模成功的大鼠，麻醉固定后，打開(kāi)腹腔，游離主動(dòng)脈，采用膠原酶消化法分離純化并培養(yǎng)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，Ⅷ 因子相關(guān)抗原鑒