CTGF對腹膜間皮細胞上皮間質表型轉化的調控及對胃癌腹膜轉移影響的研究.pdf

1、前言：胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。雖然近年來在其診治方面取得了一些成績,但預后仍不理想,我國胃癌的死亡率仍居惡性腫瘤前列。腹膜轉移是進展期胃癌根治術后最常見的復發(fā)形式,也是胃癌患者最主要的死亡原因。目前,國內外許多學者認為腹膜轉移是特殊的腫瘤細胞與腹膜適宜的環(huán)境相互作用的結果,涉及粘附、降解、移動、血管生成、免疫逃避等諸多方面。
　　 正常腹膜為三層結構:表面為單層間皮細胞層;其下為一薄的連續(xù)的膠原纖維層,內含少量基質細胞

2、,最下一層為脂肪組織層。扁平狀的間皮細胞呈連續(xù)排列,覆蓋于盆腹腔各壁的內面及腔內各器官的表面,呈半透明狀,薄而光滑,能分泌、表達多種細胞因子、粘附分子及基質成分,是一道天然的機械防御屏障,避免間皮下組織的暴露以及微生物的侵襲。進展期胃癌常發(fā)生腹膜轉移,而腹膜轉移是一個多階段的過程,在這個過程中,覆蓋在腹膜表面的間皮細胞無疑發(fā)揮著重要的作用。
　　 結締組織生長因子(connective tissue growth factor,

3、CTGF)于上世紀90年代初在血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的誘導下從人臍周靜脈內皮細胞cDNA文庫中首次發(fā)現。編碼人類CTGF的基因定位于染色體6q23.1,包含5個外顯子,4個內含子,CTGF含349個氨基酸。近年來研究發(fā)現,CTGF與細胞外基質相互作用,調節(jié)多種組織惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成及浸潤轉移。
　　 上皮-間質轉化(epithelial-mesenc

4、hymal transition,EMT)是指完全分化的上皮細胞表型改變以后轉變成完全分化的間質細胞,通常轉變?yōu)槌衫w維細胞或肌成纖維細胞的過程。EMT在正常胚胎發(fā)育及組織創(chuàng)傷修復中發(fā)揮重要作用,病理狀態(tài)下EMT主要參與器官纖維化與腫瘤浸潤轉移。EMT受多種細胞因子調節(jié),其中TGF-β被認為是導致EMT的主要分子。CTGF是TGF-β的下游效應分子,介導了TGF-β的EMT效應。有研究發(fā)現CTGF能直接誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生EM

5、T。本研究擬研究CTGF在腹膜間皮細胞EMT過程中的作用,并探討其對胃癌腹膜轉移影響。
　　 材料與方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)和處理間皮細胞系HMrSV5在37℃、5％ CO2、95％濕度溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM加10％體積分數的胎牛血清,含100U/ml青霉素和100ug/ml,貼壁生長,2-3天以1:2傳代,通過0.15％胰蛋白酶消化后收集。不同時間用不同濃度重組人CTGF(hCTGF)及腫瘤細胞上清處理問皮細胞

6、,光鏡下觀察間皮細胞處理后形態(tài)變化。
　　 二、激光共聚焦顯微鏡無菌蓋玻片經多聚賴氨酸包被后,置于六孔培養(yǎng)板。細胞均勻接種于六孔培養(yǎng)板內(5×105 per well),生長融合至80％時,按實驗需要分組,并加入處理因素處理,每組設3個復孔,取蓋玻片行免疫熒光染色方法測定HMrSV5細胞鈣粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達情況。
　　 三、蛋白印記法每組收

7、集5×106細胞,加入細胞裂解液,4℃超聲波粉碎,過夜后吸出上清液,4℃10000r/min,離心30min。調整各標本蛋白濃度一致。每孔加樣20μg,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離膠電壓120V,濃縮膠電壓100V。在水浴式轉印槽中轉膜,將PVDF膜封閉,加入一抗,4℃孵育過夜。然后將膜置于辣根過氧化物酶標記的二抗中,室溫孵育2h,TBS沈膜3×5min/次,ECL發(fā)光法檢測。
　　 四、實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(real-

8、time reversetransgript polymase chain reaetion,Real-time RT-PCR)用TRIzol試劑提取細胞總RNA,測定RNA濃度、純度,根據試劑盒步驟進行Real-time RT-PCR。采用2△CT法比較CT值(Threshold cycle),以GAPDH為內參,相對定量樣本靶基因表達水平。每一試驗至少重復三次。
　　 五、細胞粘附實驗將間皮細胞HMrSV5以每孔1×104個

9、細胞鋪于96孔板中,不同時間用不同濃度重組人CTGF(hCTGF)及腫瘤細胞上清處理間皮細胞。再加入CFSE標記的BGC823細胞,37℃,5％CO2溫箱中培養(yǎng)60min。培養(yǎng)結束后,吸出培養(yǎng)液,PBS緩慢沖洗三次,在熒光酶標讀數儀進行熒光值的測定。細胞粘附率=粘附細胞熒光強度-空白組熒光強度/細胞總數熒光強度-空白組熒光強度×100％。并在熒光顯微鏡下觀察粘附情況。
　　 六、裸鼠體內成瘤實驗取雌性裸鼠15只,分為三組,每組5

10、只。其中一組腹腔注入無血清DMEM,另外一組腹腔注入50ng/ml濃度的CTGF500ul,兩周后,取處于對數生長期的胃癌細胞株SGC-7901消化、重懸,調整細胞濃度為1×107/ml,每只裸鼠腹腔內注射胃癌細胞500ul。以上裸鼠6周后拉頸處死,觀察腹腔內成瘤及腹水情況。
　　 結果：
　　 體外實驗顯示不同濃度CTGF可使腹膜間皮細胞發(fā)生形態(tài)改變,由原來的橢圓形鋪路石樣變?yōu)殚L梭形,且排列極性消失。Real-time

11、 RT-PCR結果顯示CTGF處理過的腹膜間皮細胞E-cadherin mRNA表達下降,肌纖維細胞標志物α-SMA、Vimentin mRNA表達上升。Western-blot及免疫熒光法測定E-cadherin的蛋白表達下降,α-SMA、Vimentin蛋白表達上升。以上情況表明CTGF可誘導腹膜間皮細胞發(fā)生EMT。我們又檢測了3種胃癌高轉移細胞系SGC7901,BGC823,MGC803及間皮細胞HMrSV5上清中CTGF的含量,

12、發(fā)現3種高轉移細胞系的CTGF濃度較高,而間皮細胞HMrSV5上清中的CTGF含量很低。我們用SGC7901上清液與間皮細胞共培養(yǎng),發(fā)現E-cadherin mRNA及蛋白表達同樣下降;α-SMA、Vimentin mRNA及蛋白表達同樣上升;而且間皮細胞形態(tài)也變?yōu)殚L梭形。這說明含有較高濃度CTGF的胃癌細胞系上清液也可使腹膜間皮細胞發(fā)生EMT。我們應用CTGF-siRNA轉染胃癌細胞SGC7901,瞬時轉染后收集上清培養(yǎng)間皮細胞,其E

13、MT程度明顯降低。同時在SGC7901上清中加入CTGF中和抗體,其EMT現象被部分逆轉。通過體外粘附實驗,我們發(fā)現經過CTGF及胃癌細胞上清處理的腹膜間皮細胞與胃癌細胞的粘附率明顯高于正常間皮細胞。裸鼠體內實驗我們發(fā)現,腹腔注射重組CTGF一段時間的裸鼠較注射DMEM及未注射組的裸鼠體內瘤節(jié)結生長及腹水生成明顯增多。這說明CTGF可以誘導腹膜間皮細胞發(fā)生EMT,而且對胃癌細胞的腹膜轉移有促進作用。
　　 結論：
　　

14、1.CTGF體外可以誘導腹膜間皮細胞系HMrSV5發(fā)生EMT,而且EMT的程度與CTGF的濃度及作用時間有關。
　　 2.含有較高濃度CTGF的胃癌細胞系上清液也可使腹膜間皮細胞發(fā)生EMT,應用CTGF中和抗體可部分逆轉EMT現象。
　　 3.經過CTGF及胃癌細胞上清處理的發(fā)生EMT的腹膜間皮細胞與胃癌細胞的粘附率明顯高于正常間皮細胞。
　　 4.腹腔注射CTGF一段時間的裸鼠較注射DMEM及未注射組的裸鼠體內