CTGF對腹膜間皮細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控及對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、前言：胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。雖然近年來在其診治方面取得了一些成績,但預(yù)后仍不理想,我國胃癌的死亡率仍居惡性腫瘤前列。腹膜轉(zhuǎn)移是進展期胃癌根治術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)形式,也是胃癌患者最主要的死亡原因。目前,國內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為腹膜轉(zhuǎn)移是特殊的腫瘤細(xì)胞與腹膜適宜的環(huán)境相互作用的結(jié)果,涉及粘附、降解、移動、血管生成、免疫逃避等諸多方面。
　　 正常腹膜為三層結(jié)構(gòu):表面為單層間皮細(xì)胞層;其下為一薄的連續(xù)的膠原纖維層,內(nèi)含少量基質(zhì)細(xì)胞

2、,最下一層為脂肪組織層。扁平狀的間皮細(xì)胞呈連續(xù)排列,覆蓋于盆腹腔各壁的內(nèi)面及腔內(nèi)各器官的表面,呈半透明狀,薄而光滑,能分泌、表達多種細(xì)胞因子、粘附分子及基質(zhì)成分,是一道天然的機械防御屏障,避免間皮下組織的暴露以及微生物的侵襲。進展期胃癌常發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移,而腹膜轉(zhuǎn)移是一個多階段的過程,在這個過程中,覆蓋在腹膜表面的間皮細(xì)胞無疑發(fā)揮著重要的作用。
　　 結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,

3、CTGF)于上世紀(jì)90年代初在血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的誘導(dǎo)下從人臍周靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中首次發(fā)現(xiàn)。編碼人類CTGF的基因定位于染色體6q23.1,包含5個外顯子,4個內(nèi)含子,CTGF含349個氨基酸。近年來研究發(fā)現(xiàn),CTGF與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用,調(diào)節(jié)多種組織惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成及浸潤轉(zhuǎn)移。
　　 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenc

4、hymal transition,EMT)是指完全分化的上皮細(xì)胞表型改變以后轉(zhuǎn)變成完全分化的間質(zhì)細(xì)胞,通常轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的過程。EMT在正常胚胎發(fā)育及組織創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用,病理狀態(tài)下EMT主要參與器官纖維化與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。EMT受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié),其中TGF-β被認(rèn)為是導(dǎo)致EMT的主要分子。CTGF是TGF-β的下游效應(yīng)分子,介導(dǎo)了TGF-β的EMT效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)CTGF能直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EM

5、T。本研究擬研究CTGF在腹膜間皮細(xì)胞EMT過程中的作用,并探討其對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移影響。
　　 材料與方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)和處理間皮細(xì)胞系HMrSV5在37℃、5％ CO2、95％濕度溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM加10％體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清,含100U/ml青霉素和100ug/ml,貼壁生長,2-3天以1:2傳代,通過0.15％胰蛋白酶消化后收集。不同時間用不同濃度重組人CTGF(hCTGF)及腫瘤細(xì)胞上清處理問皮細(xì)胞

6、,光鏡下觀察間皮細(xì)胞處理后形態(tài)變化。
　　 二、激光共聚焦顯微鏡無菌蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被后,置于六孔培養(yǎng)板。細(xì)胞均勻接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)(5×105 per well),生長融合至80％時,按實驗需要分組,并加入處理因素處理,每組設(shè)3個復(fù)孔,取蓋玻片行免疫熒光染色方法測定HMrSV5細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達情況。
　　 三、蛋白印記法每組收

7、集5×106細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,4℃超聲波粉碎,過夜后吸出上清液,4℃10000r/min,離心30min。調(diào)整各標(biāo)本蛋白濃度一致。每孔加樣20μg,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離膠電壓120V,濃縮膠電壓100V。在水浴式轉(zhuǎn)印槽中轉(zhuǎn)膜,將PVDF膜封閉,加入一抗,4℃孵育過夜。然后將膜置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中,室溫孵育2h,TBS沈膜3×5min/次,ECL發(fā)光法檢測。
　　 四、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-

8、time reversetransgript polymase chain reaetion,Real-time RT-PCR)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,測定RNA濃度、純度,根據(jù)試劑盒步驟進行Real-time RT-PCR。采用2△CT法比較CT值(Threshold cycle),以GAPDH為內(nèi)參,相對定量樣本靶基因表達水平。每一試驗至少重復(fù)三次。
　　 五、細(xì)胞粘附實驗將間皮細(xì)胞HMrSV5以每孔1×104個

9、細(xì)胞鋪于96孔板中,不同時間用不同濃度重組人CTGF(hCTGF)及腫瘤細(xì)胞上清處理間皮細(xì)胞。再加入CFSE標(biāo)記的BGC823細(xì)胞,37℃,5％CO2溫箱中培養(yǎng)60min。培養(yǎng)結(jié)束后,吸出培養(yǎng)液,PBS緩慢沖洗三次,在熒光酶標(biāo)讀數(shù)儀進行熒光值的測定。細(xì)胞粘附率=粘附細(xì)胞熒光強度-空白組熒光強度/細(xì)胞總數(shù)熒光強度-空白組熒光強度×100％。并在熒光顯微鏡下觀察粘附情況。
　　 六、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗取雌性裸鼠15只,分為三組,每組5

10、只。其中一組腹腔注入無血清DMEM,另外一組腹腔注入50ng/ml濃度的CTGF500ul,兩周后,取處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株SGC-7901消化、重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml,每只裸鼠腹腔內(nèi)注射胃癌細(xì)胞500ul。以上裸鼠6周后拉頸處死,觀察腹腔內(nèi)成瘤及腹水情況。
　　 結(jié)果：
　　 體外實驗顯示不同濃度CTGF可使腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變,由原來的橢圓形鋪路石樣變?yōu)殚L梭形,且排列極性消失。Real-time

11、 RT-PCR結(jié)果顯示CTGF處理過的腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA表達下降,肌纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin mRNA表達上升。Western-blot及免疫熒光法測定E-cadherin的蛋白表達下降,α-SMA、Vimentin蛋白表達上升。以上情況表明CTGF可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT。我們又檢測了3種胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SGC7901,BGC823,MGC803及間皮細(xì)胞HMrSV5上清中CTGF的含量,

12、發(fā)現(xiàn)3種高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的CTGF濃度較高,而間皮細(xì)胞HMrSV5上清中的CTGF含量很低。我們用SGC7901上清液與間皮細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)E-cadherin mRNA及蛋白表達同樣下降;α-SMA、Vimentin mRNA及蛋白表達同樣上升;而且間皮細(xì)胞形態(tài)也變?yōu)殚L梭形。這說明含有較高濃度CTGF的胃癌細(xì)胞系上清液也可使腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT。我們應(yīng)用CTGF-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901,瞬時轉(zhuǎn)染后收集上清培養(yǎng)間皮細(xì)胞,其E

13、MT程度明顯降低。同時在SGC7901上清中加入CTGF中和抗體,其EMT現(xiàn)象被部分逆轉(zhuǎn)。通過體外粘附實驗,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過CTGF及胃癌細(xì)胞上清處理的腹膜間皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的粘附率明顯高于正常間皮細(xì)胞。裸鼠體內(nèi)實驗我們發(fā)現(xiàn),腹腔注射重組CTGF一段時間的裸鼠較注射DMEM及未注射組的裸鼠體內(nèi)瘤節(jié)結(jié)生長及腹水生成明顯增多。這說明CTGF可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT,而且對胃癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移有促進作用。
　　 結(jié)論：
　　

14、1.CTGF體外可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5發(fā)生EMT,而且EMT的程度與CTGF的濃度及作用時間有關(guān)。
　　 2.含有較高濃度CTGF的胃癌細(xì)胞系上清液也可使腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT,應(yīng)用CTGF中和抗體可部分逆轉(zhuǎn)EMT現(xiàn)象。
　　 3.經(jīng)過CTGF及胃癌細(xì)胞上清處理的發(fā)生EMT的腹膜間皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的粘附率明顯高于正常間皮細(xì)胞。
　　 4.腹腔注射CTGF一段時間的裸鼠較注射DMEM及未注射組的裸鼠體內(nèi)