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文檔簡介
1、背景/目的:
腹膜透析(Peritoneal Dialysis,PD)是終末期腎病替代治療的主要手段之一。在許多國家和地區(qū)被推薦為終末期腎病一體化治療的首選方式。但令人遺憾的是隨著透析時間的延長,PD的透析效能逐年下降,尤其是發(fā)生超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)的發(fā)生,成為PD技術(shù)失敗的主要原因和阻礙PD的進一步發(fā)展的主要障礙。UFF的發(fā)生的實質(zhì)腹膜纖維化(Peritoneal Fibrosi
2、s,PF)。闡明PD相關性PF的發(fā)生機制以及探索保護腹膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的策略已成為腎臟替代治療領域面臨的重大挑戰(zhàn)。腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化(Mesothelial-to-Mesenchymal Transition,MMT)被認為是PF的早期的、可逆的病理生理過程。因此,如果能夠在起始階段干預腹膜間皮細胞MMT將有可能為拮抗甚至逆轉(zhuǎn)PF提供新的策略。腹膜間皮細胞發(fā)生MMT的機制仍不清楚。目前已有的證據(jù)認為TGF-β1/Smad信號通路,是多
3、種外來刺激因素誘導腹膜間皮細胞MMT的發(fā)生和進展的共同的、關鍵的信號通路,并有可能成為干預MMT的新靶點。我們前期的研究表明中藥黃芪可以明顯提高透析效能,增加透析超濾量,提高腹膜對溶質(zhì)的清除能力。動物實驗的結(jié)果表明黃芪減少腹膜組織TGF-β1、p-Smad2/3在腹膜的表達,而且能夠減少腹膜巨噬細胞的募集,減少MCP-1的表達,拮抗腹膜炎癥反應。然而確切的分子機制并不清楚。因此本研究的第一部分擬通過構(gòu)建TGF-β1誘導的腹膜間皮細胞MM
4、T模型,基于TGF-β1/Smad信號通路探討中藥黃芪有效成分黃芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)拮抗的腹膜間皮細胞MMT的分子機制。
NLRP3炎性體(inflammasome)是胞漿內(nèi)一組復雜的多蛋白復合體,是caspase-1活化所必需的反應平臺,調(diào)控IL-1β、IL-18等促炎細胞因子的加工及活化。它主要由NLRP3、ASC(銜接蛋白)、caspase-1(效應蛋白)構(gòu)成。其中NLRP3是胞漿內(nèi)最重要的模
5、式識別受體之一,不僅能識別病原體相關分子模式,還能夠識別損傷相關的分子模式,NLRP3被激活后起始炎癥復合體的組裝,招募ASC和Caspase-1,促使自身寡聚體化,使Pro-caspase-1實現(xiàn)空間距離的接近,進而通過自身切割形成成熟的Caspase-1。caspase-1活化后酶切無活性前體形式合成的pro-IL-1β形成有生物活性的成熟IL-1β,是啟動IL-1β、IL-18等重要促炎細胞因子產(chǎn)生及分泌的關鍵步驟。越來越多的研究
6、表明,NLRP3炎性體可能是溝通代謝紊亂和炎癥的分子橋梁。除了通過病原微生物模式分子激活外,細胞外高糖、ATP、膽固醇、尿酸結(jié)晶、酸中毒等代謝相關的刺激物可以通過離子通道模型、ROS模型、溶酶體破壞模型激活NLRP3炎性體造成組織損傷。因此NLRP3炎癥體在慢性無菌性炎癥、自身免疫性疾病、代謝性疾病等病理過程中的作用及意義日益受到關注。NLRP3炎癥體活化的相關研究主要集中于來源于骨髓的固有免疫細胞,其在腹膜間皮細胞中的病理生理作用仍不
7、清楚。我們知道PMCs長期直接暴露于異常代謝環(huán)境(高糖(1.5%-4.25%),高滲(346-490mOsm/L),低PH值(5.0-5.8)和葡萄糖代謝產(chǎn)物的腹膜透析液)中,很可能存在NLRP3炎性體持續(xù)活化,產(chǎn)生caspase-1、IL-1β、IL-18等效應分子介導腹膜組織炎癥反應和結(jié)構(gòu)重塑。因此本研究第二部分擬通過高糖腹膜透析液誘導腹膜間皮細胞MMT的體外模型證明NLRP3炎性體活化在腹膜間皮細胞MMT的關鍵作用。另外,有證據(jù)表
8、明黃芪及其有效成分黃芪甲苷具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化作用等的現(xiàn)代藥理作用,我們前期的研究證明黃芪可以減輕高糖腹膜透析液誘導的腹膜組織局部的炎癥反應,拮抗腹膜結(jié)構(gòu)重塑的作用,但是確切的機制并不清楚。因此本部分研究擬回答下列2個問題:NLRP3炎癥體的活化是否介導了含糖PD液誘導的腹膜間皮細胞MMT; AS-Ⅳ是否能夠阻斷NLRP3炎癥體的活化從而發(fā)揮拮抗腹膜間皮細胞MMT的作用。
方法:
第一部分:①.細胞培養(yǎng):人腹膜
9、間皮細胞(HMrSV5 cells ATCC)培養(yǎng)于含10%(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2、飽和濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中,觀察細胞生長狀態(tài),每2天更換培養(yǎng)基。所有的實驗在細胞接種如細胞培養(yǎng)板后24h-48h實施。為了誘導HMrSV5細胞發(fā)生MMT,用TGF-β1(2 ng/ml)處理細胞。②細胞活力實驗:應用不同濃度的AS-Ⅳ(0,10,50,100,200和400μg/m
10、l)刺激24小時,和400μg/ml AS-Ⅳ刺激不同時間(0,12,24,36,48和72h)后應用counting kit-8(CCK-8) assay試劑盒進行分析。③細胞被隨機分為對照組(0.1% DMSO),AS-Ⅳ單獨處理組(400μg/ml),TGF-β單獨處理組(10 ng/ml),TGF-β1+不同濃度AS-Ⅳ或者TGF-β1+NAC組。應用TRIzol法完成總RNA的提取,cDNA的制備以及realtimePCR的操
11、作根據(jù)產(chǎn)品操作說明書完成。所以mRNA的定量結(jié)果以與內(nèi)參基因GAPDH比值表示,用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。RIPA緩沖液裂解細胞后,提取總蛋白,應用BCA ProteinAssay試劑盒對總蛋白進行定量,電泳、轉(zhuǎn)膜,第一和第二抗體孵育以及顯色均按照產(chǎn)品操作說明進行,用imageJ軟件分析數(shù)據(jù)。④活性氧水平測定:細胞隨機分為對照組(0.1% DMSO)、TGF-β1處理組(10 ng/ml)、AS-Ⅳ+ TGF-β1組(提前2小時用400
12、μg/ml AS-Ⅳ預處理+2ng/ml TGF-β1)和NAC組(提前兩小時NAC100 nM+2 ng/ml TGF-β1)。用DCFH2-DA熒光法檢測ROS水平。⑤細胞轉(zhuǎn)染實驗:用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建穩(wěn)定表達目的基因的細胞株。然后將細胞分為對照組(0.1% DMSO),TGF-β1組(2 ng/ml),AS-Ⅳ+TGF-β1組(提前2小時用400μg/ml AS-Ⅳ預處理+2 ng/ml TGF-β1),TGF-β1+Smad7
13、overexpression(OE)組,TGF-β1+AS-Ⅳ+Smad7 knockdown(KD)組。然后進行western blotting分析(方法同上)和細胞遷移侵襲實驗。
第二部分:①為了證明含糖腹透液可以誘導腹膜間皮細胞MMT,并可以誘導NLRP3炎癥體活化,細胞隨機分為9組:(1)空白組:正常培養(yǎng)液;(2)含1.5%葡萄糖PD液處理24h組;(3)含2.5%葡萄糖PD液處理24h組:(4)含4.25%葡萄糖PD
14、液處理24h組;(5)含4.25%葡萄糖PD液刺激0h:(6)含4.25%葡萄糖PD液刺激6h;(7)含4.25%葡萄糖PD液刺激12h;(8)含4.25%葡萄糖PD液刺激24h;(9)含4.25%葡萄糖PD液刺激48h。收集細胞,提取蛋白并收集細胞上清液分別應用westernblot和ELISA檢測各蛋白表達。②為了進一步說明NLRP3炎癥體激活在高糖腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞MMT中的關鍵作用,我們構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NLRP3siRN
15、A的細胞株,阻斷細胞內(nèi)NLRP3表達水平。實驗分為5組:(1)正常細胞組;(2) scramble RNA組;(3) siNLRP3組;(4)4.25%腹透液刺激組;(5)4.25%腹透液+siNLRP3組。收集細胞上清并收集細胞、提取蛋白。應用Westernblot檢測各組蛋白表達。③為了證明AS-Ⅳ通過抑制NLRP3炎癥體的活化部分阻斷高糖腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞MMT。細胞隨機分為7組:(1)空白組:正常培養(yǎng)液;(2)4.25
16、%腹膜透析液組;(3) AS-Ⅳ(400ug/ml)組;(4)10ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液;(5)100ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液;(6)200ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液;(7)400ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液。細胞提前2h用AS-Ⅳ處理,然后加入4.25%腹膜透析液孵育24小時。收集細胞提取蛋白同時留取細胞培養(yǎng)上清液分別行western blot和ELISA分析。
結(jié)
17、果:
第一部分:①不同劑量的AS-Ⅳ處理24小時以及400ug/ml AS-Ⅳ在不同的時間點對于細胞的活力均沒有明顯影響。②在應用2 ng/ml TGFβ1刺激24小時以后,腹膜間皮細胞的上皮標志E-Cadherin的表達下調(diào),而間充質(zhì)細胞標志vimentin,α-SMA以及collagenⅠ的表達均上調(diào)(P<0.05)。與此同時phospho-Smad2/3的表達也顯著上調(diào)(P<0.05),而經(jīng)過AS-Ⅳ預處理的細胞能夠抑制
18、Smad2/3的活化,拮抗TGF-β1誘導的入腹膜間皮細胞MMT。而Smad2/3下游的兩個與MMT密切相關的核轉(zhuǎn)錄因子snaill和snail2在核酸水平也被AS-Ⅳ所抑制(P<0.05)。③在TGF-β1刺激人腹膜間皮細胞后活化Smad2/3,phospho-Smad2/3表達上調(diào),同時Smad7表達下調(diào)。而AS-Ⅳ可以劑量依賴性地下調(diào)phospho-Smad2/3的表達,與此同時AS-Ⅳ可以在蛋白水平上劑量依賴性地上調(diào)smad7的
19、表達。但是在核酸水平,沒有觀察到AS-Ⅳ對Smad7的影響。另外,無論是在TGF-β1處理后還是不同劑量的AS-Ⅳ處理后,TGF-β1的兩個主要膜受體TGRBⅠ和TGRBⅡ表達水平均未受影響。④TGFβ1(2 ng/m)刺激腹膜間皮細胞24小時后,活性氧ROS的水平明顯升高(P<0/05)。無論是AS-Ⅳ還是N-乙酰半胱氨酸(100nM),都可以下調(diào)ROS的水平。而N-乙酰半胱氨酸雖然下調(diào)了ROS水平,卻沒有抑制Smad2/3的活化和T
20、GF-β1誘導的人腹膜間皮細胞的MMT。⑤慢病毒轉(zhuǎn)染的方式獲得了滿意的抑制smad7表達和過表達smad7的效果。過表達Smad7可以明顯抑制TGFβ1誘導MMT(P<0.05)。另外,AS-Ⅳ可以下調(diào)vimentin表達的作用可以部分被Smad7的敲除所逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。應用細胞transwell侵襲實驗進一步證明了上述結(jié)果。
第二部分:①含糖腹膜透析液可以劑量性地上調(diào)細胞上清中IL-18的水平。(p<0.05)。而4.
21、25%PD液可以呈時間依賴性地上調(diào)細胞培養(yǎng)上清液IL-18的水平(p<0.05)。應用westernblot檢測發(fā)現(xiàn)高糖腹膜透析液可以誘導腹膜間皮細胞發(fā)生MMT,表現(xiàn)為上皮標志物E-cadherin表達下調(diào),而間充質(zhì)細胞標志物vimentine、α-SMA表達上調(diào)(p<0.05),而且上述作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。高糖腹膜透析液在誘導腹膜間皮細胞發(fā)生MMT的過程中,可以呈時間和劑量依賴性地激活了NLRP3炎癥體相關組分(NLRP3、pr
22、o-casepase-1、pro-IL-1β、IL-1β)(p<0.05)。②應用Westernblot檢測各組蛋白表達,結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)NLRP3siRNA可以在蛋白水平穩(wěn)定的下調(diào)NLRP3的表達(p<0.05)。4.25%腹膜透析液可以上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β的表達(p<0.05),而轉(zhuǎn)染NLRP3siRNA能夠部分地阻斷4.25%PD液誘導的NLRP3炎癥體活化,NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β表達下調(diào)
23、(p<0.05),在這一過程中Pro-caspase-1表達水平無明顯變化(p>0.05);4.25%腹膜透析液可以誘導腹膜間皮細胞發(fā)生MMT,上皮細胞標志物E-cadhrin表達下調(diào),而間充質(zhì)細胞標志物vimentin和α-SMA表達上調(diào)(P<0.05)。而NLRP3siRNA能夠部分阻斷4.25%腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞MMT(p<0.05)。進一步應用ELISA方法發(fā)現(xiàn),4.25%腹膜透析液可以上調(diào)細胞上清中IL-18的表達(
24、p<0.05),而NLRP3siRNA可以下調(diào)細胞上清液中IL-18的水平(p<0.05)。③4.25%腹膜透析液處理24h能夠顯著誘導NLRP3炎癥體活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表達上調(diào)(p<0.05)。同時能夠誘導腹膜間皮細胞發(fā)生MMT,上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)而間充質(zhì)細胞標志蛋白vimentin和α-SMA表達上調(diào)(p<0.05)。AS-Ⅳ可以濃度依賴性地阻斷炎癥體
25、的活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表達下調(diào)(p<0.05),同時可以濃度依賴性地抑制腹膜間皮細胞MMT,上皮細胞標志物E-cadherin表達上調(diào)而間充質(zhì)細胞標志蛋白vimentin和α-SMA表達下調(diào)(p<0.05)。
結(jié)論:
?、賂GF-β1可以活化Smad2/3并誘導人腹膜間皮細胞HMrSV5發(fā)生MMT;②AS-Ⅳ可以通過直接作用于smad7,上調(diào)Smad7的表達,從而
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