黃芪甲苷干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景/目的：
　　腹膜透析(Peritoneal Dialysis,PD)是終末期腎病替代治療的主要手段之一。在許多國家和地區(qū)被推薦為終末期腎病一體化治療的首選方式。但令人遺憾的是隨著透析時(shí)間的延長,PD的透析效能逐年下降,尤其是發(fā)生超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)的發(fā)生,成為PD技術(shù)失敗的主要原因和阻礙PD的進(jìn)一步發(fā)展的主要障礙。UFF的發(fā)生的實(shí)質(zhì)腹膜纖維化(Peritoneal Fibrosi

2、s,PF)。闡明PD相關(guān)性PF的發(fā)生機(jī)制以及探索保護(hù)腹膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的策略已成為腎臟替代治療領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Mesothelial-to-Mesenchymal Transition,MMT)被認(rèn)為是PF的早期的、可逆的病理生理過程。因此,如果能夠在起始階段干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞MMT將有可能為拮抗甚至逆轉(zhuǎn)PF提供新的策略。腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生MMT的機(jī)制仍不清楚。目前已有的證據(jù)認(rèn)為TGF-β1/Smad信號通路,是多

3、種外來刺激因素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞MMT的發(fā)生和進(jìn)展的共同的、關(guān)鍵的信號通路,并有可能成為干預(yù)MMT的新靶點(diǎn)。我們前期的研究表明中藥黃芪可以明顯提高透析效能,增加透析超濾量,提高腹膜對溶質(zhì)的清除能力。動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明黃芪減少腹膜組織TGF-β1、p-Smad2/3在腹膜的表達(dá),而且能夠減少腹膜巨噬細(xì)胞的募集,減少M(fèi)CP-1的表達(dá),拮抗腹膜炎癥反應(yīng)。然而確切的分子機(jī)制并不清楚。因此本研究的第一部分?jǐn)M通過構(gòu)建TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞MM

4、T模型,基于TGF-β1/Smad信號通路探討中藥黃芪有效成分黃芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)拮抗的腹膜間皮細(xì)胞MMT的分子機(jī)制。
　　NLRP3炎性體(inflammasome)是胞漿內(nèi)一組復(fù)雜的多蛋白復(fù)合體,是caspase-1活化所必需的反應(yīng)平臺,調(diào)控IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子的加工及活化。它主要由NLRP3、ASC（銜接蛋白）、caspase-1（效應(yīng)蛋白）構(gòu)成。其中NLRP3是胞漿內(nèi)最重要的模

5、式識別受體之一,不僅能識別病原體相關(guān)分子模式,還能夠識別損傷相關(guān)的分子模式,NLRP3被激活后起始炎癥復(fù)合體的組裝,招募ASC和Caspase-1,促使自身寡聚體化,使Pro-caspase-1實(shí)現(xiàn)空間距離的接近,進(jìn)而通過自身切割形成成熟的Caspase-1。caspase-1活化后酶切無活性前體形式合成的pro-IL-1β形成有生物活性的成熟IL-1β,是啟動IL-1β、IL-18等重要促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生及分泌的關(guān)鍵步驟。越來越多的研究

6、表明,NLRP3炎性體可能是溝通代謝紊亂和炎癥的分子橋梁。除了通過病原微生物模式分子激活外,細(xì)胞外高糖、ATP、膽固醇、尿酸結(jié)晶、酸中毒等代謝相關(guān)的刺激物可以通過離子通道模型、ROS模型、溶酶體破壞模型激活NLRP3炎性體造成組織損傷。因此NLRP3炎癥體在慢性無菌性炎癥、自身免疫性疾病、代謝性疾病等病理過程中的作用及意義日益受到關(guān)注。NLRP3炎癥體活化的相關(guān)研究主要集中于來源于骨髓的固有免疫細(xì)胞,其在腹膜間皮細(xì)胞中的病理生理作用仍不

7、清楚。我們知道PMCs長期直接暴露于異常代謝環(huán)境（高糖（1.5％-4.25％）,高滲（346-490mOsm/L）,低PH值(5.0-5.8)和葡萄糖代謝產(chǎn)物的腹膜透析液）中,很可能存在NLRP3炎性體持續(xù)活化,產(chǎn)生caspase-1、IL-1β、IL-18等效應(yīng)分子介導(dǎo)腹膜組織炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重塑。因此本研究第二部分?jǐn)M通過高糖腹膜透析液誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞MMT的體外模型證明NLRP3炎性體活化在腹膜間皮細(xì)胞MMT的關(guān)鍵作用。另外,有證據(jù)表

8、明黃芪及其有效成分黃芪甲苷具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化作用等的現(xiàn)代藥理作用,我們前期的研究證明黃芪可以減輕高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜組織局部的炎癥反應(yīng),拮抗腹膜結(jié)構(gòu)重塑的作用,但是確切的機(jī)制并不清楚。因此本部分研究擬回答下列2個(gè)問題:NLRP3炎癥體的活化是否介導(dǎo)了含糖PD液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞MMT; AS-Ⅳ是否能夠阻斷NLRP3炎癥體的活化從而發(fā)揮拮抗腹膜間皮細(xì)胞MMT的作用。
　　方法：
　　第一部分:①.細(xì)胞培養(yǎng):人腹膜

9、間皮細(xì)胞(HMrSV5 cells ATCC)培養(yǎng)于含10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5％CO2、飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,觀察細(xì)胞生長狀態(tài),每2天更換培養(yǎng)基。所有的實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞接種如細(xì)胞培養(yǎng)板后24h-48h實(shí)施。為了誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞發(fā)生MMT,用TGF-β1(2 ng/ml)處理細(xì)胞。②細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn):應(yīng)用不同濃度的AS-Ⅳ(0,10,50,100,200和400μg/m

10、l)刺激24小時(shí),和400μg/ml AS-Ⅳ刺激不同時(shí)間(0,12,24,36,48和72h)后應(yīng)用counting kit-8(CCK-8) assay試劑盒進(jìn)行分析。③細(xì)胞被隨機(jī)分為對照組(0.1％ DMSO),AS-Ⅳ單獨(dú)處理組(400μg/ml),TGF-β單獨(dú)處理組(10 ng/ml),TGF-β1+不同濃度AS-Ⅳ或者TGF-β1+NAC組。應(yīng)用TRIzol法完成總RNA的提取,cDNA的制備以及realtimePCR的操

11、作根據(jù)產(chǎn)品操作說明書完成。所以mRNA的定量結(jié)果以與內(nèi)參基因GAPDH比值表示,用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。RIPA緩沖液裂解細(xì)胞后,提取總蛋白,應(yīng)用BCA ProteinAssay試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量,電泳、轉(zhuǎn)膜,第一和第二抗體孵育以及顯色均按照產(chǎn)品操作說明進(jìn)行,用imageJ軟件分析數(shù)據(jù)。④活性氧水平測定:細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(0.1％ DMSO)、TGF-β1處理組(10 ng/ml)、AS-Ⅳ+ TGF-β1組(提前2小時(shí)用400

12、μg/ml AS-Ⅳ預(yù)處理+2ng/ml TGF-β1)和NAC組(提前兩小時(shí)NAC100 nM+2 ng/ml TGF-β1)。用DCFH2-DA熒光法檢測ROS水平。⑤細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。然后將細(xì)胞分為對照組(0.1％ DMSO),TGF-β1組(2 ng/ml),AS-Ⅳ+TGF-β1組(提前2小時(shí)用400μg/ml AS-Ⅳ預(yù)處理+2 ng/ml TGF-β1),TGF-β1+Smad7

13、overexpression(OE)組,TGF-β1+AS-Ⅳ+Smad7 knockdown(KD)組。然后進(jìn)行western blotting分析（方法同上）和細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分:①為了證明含糖腹透液可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞MMT,并可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥體活化,細(xì)胞隨機(jī)分為9組:(1)空白組:正常培養(yǎng)液;(2)含1.5％葡萄糖PD液處理24h組;(3)含2.5％葡萄糖PD液處理24h組:(4)含4.25％葡萄糖PD

14、液處理24h組;(5)含4.25％葡萄糖PD液刺激0h:(6)含4.25％葡萄糖PD液刺激6h;(7)含4.25％葡萄糖PD液刺激12h;(8)含4.25％葡萄糖PD液刺激24h;(9)含4.25％葡萄糖PD液刺激48h。收集細(xì)胞,提取蛋白并收集細(xì)胞上清液分別應(yīng)用westernblot和ELISA檢測各蛋白表達(dá)。②為了進(jìn)一步說明NLRP3炎癥體激活在高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞MMT中的關(guān)鍵作用,我們構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NLRP3siRN

15、A的細(xì)胞株,阻斷細(xì)胞內(nèi)NLRP3表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分為5組:(1)正常細(xì)胞組;(2) scramble RNA組;(3) siNLRP3組;(4)4.25％腹透液刺激組;(5)4.25％腹透液+siNLRP3組。收集細(xì)胞上清并收集細(xì)胞、提取蛋白。應(yīng)用Westernblot檢測各組蛋白表達(dá)。③為了證明AS-Ⅳ通過抑制NLRP3炎癥體的活化部分阻斷高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞MMT。細(xì)胞隨機(jī)分為7組:(1)空白組:正常培養(yǎng)液;(2)4.25

16、％腹膜透析液組;(3) AS-Ⅳ(400ug/ml)組;(4)10ug/mlAS-Ⅳ+4.25％腹膜透析液;(5)100ug/mlAS-Ⅳ+4.25％腹膜透析液;(6)200ug/mlAS-Ⅳ+4.25％腹膜透析液;(7)400ug/mlAS-Ⅳ+4.25％腹膜透析液。細(xì)胞提前2h用AS-Ⅳ處理,然后加入4.25％腹膜透析液孵育24小時(shí)。收集細(xì)胞提取蛋白同時(shí)留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別行western blot和ELISA分析。
　　結(jié)

17、果：
　　第一部分:①不同劑量的AS-Ⅳ處理24小時(shí)以及400ug/ml AS-Ⅳ在不同的時(shí)間點(diǎn)對于細(xì)胞的活力均沒有明顯影響。②在應(yīng)用2 ng/ml TGFβ1刺激24小時(shí)以后,腹膜間皮細(xì)胞的上皮標(biāo)志E-Cadherin的表達(dá)下調(diào),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志vimentin,α-SMA以及collagenⅠ的表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05)。與此同時(shí)phospho-Smad2/3的表達(dá)也顯著上調(diào)(P＜0.05),而經(jīng)過AS-Ⅳ預(yù)處理的細(xì)胞能夠抑制

18、Smad2/3的活化,拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的入腹膜間皮細(xì)胞MMT。而Smad2/3下游的兩個(gè)與MMT密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子snaill和snail2在核酸水平也被AS-Ⅳ所抑制(P＜0.05)。③在TGF-β1刺激人腹膜間皮細(xì)胞后活化Smad2/3,phospho-Smad2/3表達(dá)上調(diào),同時(shí)Smad7表達(dá)下調(diào)。而AS-Ⅳ可以劑量依賴性地下調(diào)phospho-Smad2/3的表達(dá),與此同時(shí)AS-Ⅳ可以在蛋白水平上劑量依賴性地上調(diào)smad7的

19、表達(dá)。但是在核酸水平,沒有觀察到AS-Ⅳ對Smad7的影響。另外,無論是在TGF-β1處理后還是不同劑量的AS-Ⅳ處理后,TGF-β1的兩個(gè)主要膜受體TGRBⅠ和TGRBⅡ表達(dá)水平均未受影響。④TGFβ1(2 ng/m)刺激腹膜間皮細(xì)胞24小時(shí)后,活性氧ROS的水平明顯升高(P＜0/05)。無論是AS-Ⅳ還是N-乙酰半胱氨酸(100nM),都可以下調(diào)ROS的水平。而N-乙酰半胱氨酸雖然下調(diào)了ROS水平,卻沒有抑制Smad2/3的活化和T

20、GF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞的MMT。⑤慢病毒轉(zhuǎn)染的方式獲得了滿意的抑制smad7表達(dá)和過表達(dá)smad7的效果。過表達(dá)Smad7可以明顯抑制TGFβ1誘導(dǎo)MMT(P＜0.05)。另外,AS-Ⅳ可以下調(diào)vimentin表達(dá)的作用可以部分被Smad7的敲除所逆轉(zhuǎn)(P＜0.05)。應(yīng)用細(xì)胞transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了上述結(jié)果。
　　第二部分:①含糖腹膜透析液可以劑量性地上調(diào)細(xì)胞上清中IL-18的水平。(p＜0.05)。而4.

21、25％PD液可以呈時(shí)間依賴性地上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18的水平(p＜0.05）。應(yīng)用westernblot檢測發(fā)現(xiàn)高糖腹膜透析液可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生MMT,表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentine、α-SMA表達(dá)上調(diào)(p＜0.05),而且上述作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。高糖腹膜透析液在誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生MMT的過程中,可以呈時(shí)間和劑量依賴性地激活了NLRP3炎癥體相關(guān)組分（NLRP3、pr

22、o-casepase-1、pro-IL-1β、IL-1β）(p＜0.05)。②應(yīng)用Westernblot檢測各組蛋白表達(dá),結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)NLRP3siRNA可以在蛋白水平穩(wěn)定的下調(diào)NLRP3的表達(dá)(p＜0.05）。4.25％腹膜透析液可以上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β的表達(dá)(p＜0.05),而轉(zhuǎn)染NLRP3siRNA能夠部分地阻斷4.25％PD液誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體活化,NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β表達(dá)下調(diào)

23、(p＜0.05),在這一過程中Pro-caspase-1表達(dá)水平無明顯變化(p＞0.05);4.25％腹膜透析液可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生MMT,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadhrin表達(dá)下調(diào),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。而NLRP3siRNA能夠部分阻斷4.25％腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞MMT(p＜0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用ELISA方法發(fā)現(xiàn),4.25％腹膜透析液可以上調(diào)細(xì)胞上清中IL-18的表達(dá)(

24、p＜0.05),而NLRP3siRNA可以下調(diào)細(xì)胞上清液中IL-18的水平(p＜0.05)。③4.25％腹膜透析液處理24h能夠顯著誘導(dǎo)NLRP3炎癥體活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)。同時(shí)能夠誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生MMT,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)。AS-Ⅳ可以濃度依賴性地阻斷炎癥體

25、的活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表達(dá)下調(diào)(p＜0.05),同時(shí)可以濃度依賴性地抑制腹膜間皮細(xì)胞MMT,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin和α-SMA表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　?、賂GF-β1可以活化Smad2/3并誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5發(fā)生MMT;②AS-Ⅳ可以通過直接作用于smad7,上調(diào)Smad7的表達(dá),從而