多拉菌素產(chǎn)生菌基因組重排育種.pdf

1、多拉菌素是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,屬于阿維菌素第三代衍生物。其抗寄生蟲范圍廣泛,作用獨(dú)特,與其它抗寄生蟲藥物無交叉耐藥性,效果好,是目前具有開發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲藥物。本論文通過基因組重排技術(shù)選育多拉菌素高產(chǎn)菌株,用響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,同時(shí)采用單因素方法優(yōu)化多拉菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件,為大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的工藝參數(shù)。
　　 首先對原始菌株進(jìn)行分離復(fù)壯,采用傳統(tǒng)的紫外輻射和亞硝基胍誘變選育高產(chǎn)菌株做為基因組重排育種的出發(fā)菌株。同時(shí)

2、優(yōu)化了原生質(zhì)體制備和融合條件。最佳方法為添加0.5％甘氨酸的YEME作為制備原生質(zhì)體的菌絲培養(yǎng)基,培養(yǎng)20h后收集菌絲體用加入35顆玻璃珠的250ml搖瓶、250rpm振蕩45min打碎菌絲體,3mg/ml溶菌酶、30℃作用30min。原生質(zhì)體制備率和再生率分別達(dá)到了88.9％、4.4％。最適融合條件為40％的PEG4000作用3min,融合率為8.3960。
　　 將誘變得來的高產(chǎn)菌株制備成原生質(zhì)體,分別采用紫外照射200s、

3、60℃溫浴40min滅活后融合,用5μg/ml的鏈霉素抗性篩選第一輪基因組重排高產(chǎn)菌株。第一輪篩選得到的高產(chǎn)菌株作為第二輪基因組重排的出發(fā)菌株,如此重復(fù)進(jìn)行4輪基因組重排。鏈霉素的抗性濃度分別是5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml。最后得到一株多拉菌素產(chǎn)量為547mg/l的遺傳穩(wěn)定菌株F4-120。其產(chǎn)量分別是原始菌株(103mg/l)和第一輪重排出發(fā)菌株最高產(chǎn)量(147mg/l)的531.07％、372.11％

4、。同時(shí)比較了原始菌株和重組菌株的發(fā)酵參數(shù)。
　　 采用響應(yīng)面方法優(yōu)化了基因組重排菌株F4-120的發(fā)酵配方,得到玉米淀粉、蛋白胨和碳酸鈣為顯著影響因素,優(yōu)化后的濃度分別為118.9g/l、17.16g/l和10.18g/l。多拉菌素產(chǎn)量達(dá)到672mg/l,與優(yōu)化前相比提高了23％。
　　 另外本論文確定了多拉菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、裝量、種子培養(yǎng)時(shí)間和移種量?？疾炝嗣舾卸取⑶绑w添加時(shí)間和濃度及發(fā)酵過程中