井岡霉素高產(chǎn)的比較功能基因組研究.pdf

1、井岡霉素是我國自主開發(fā)、應(yīng)用面積最廣、產(chǎn)業(yè)化最為成功的農(nóng)用抗生素之一，主要用于防治水稻紋枯病，同時也是糖尿病治療藥物伏格列波糖合成的重要前體，具有較高的產(chǎn)品附加值。井岡霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌井岡變種是上世紀(jì)70年代由沈寅初院士從井岡山地區(qū)分離到的，其正常生長溫度為30℃，但在發(fā)酵溫度為37℃時，產(chǎn)量有大幅度提高。在搖瓶發(fā)酵條件下，實(shí)驗(yàn)室菌株5008的產(chǎn)量約為2克/升，經(jīng)過四十年的傳統(tǒng)誘變育種，其衍生的工業(yè)菌株TL01產(chǎn)量達(dá)到18克/升，在

2、工廠發(fā)酵罐中甚至高達(dá)30克/升，發(fā)酵周期僅為2天。因此，該類菌株具有產(chǎn)量高、發(fā)酵溫度高和發(fā)酵周期短等優(yōu)良特性，這為通過比較功能基因組學(xué)研究揭示井岡霉素的高產(chǎn)機(jī)制提供了極佳的研究材料。本論文主要分為以下四個部分。
　　第一部分，井岡霉素產(chǎn)生菌5008基因組完整圖譜的構(gòu)建與解析
　　利用454測序技術(shù)測定了菌株5008的基因組序列，使用各種文庫（6-8 kb質(zhì)粒文庫和fosmid文庫）末端序列信息、數(shù)據(jù)分析與基本分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)

3、行了草圖中缺口的填補(bǔ)，并結(jié)合特殊的末端片段克隆方法識別了5008基因組的四個端粒，成功構(gòu)建了5008基因組的完整圖譜。除了大小為10,145,833 bp線型染色體外，通過脈沖場電泳還發(fā)現(xiàn)了164,566 bp的線型質(zhì)粒，同時結(jié)合大質(zhì)粒提取和電泳分析還確認(rèn)了73,285 bp的環(huán)型質(zhì)粒。
　　鏈霉菌基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，5008染色體有著相對較小的核心區(qū)（5.56 Mb）、最短的末端反向重復(fù)序列（14 bp），并編碼了更多（比例）

4、的α/β水解酶、MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鎂離子/錳離子依賴的磷酸酶。還編碼了29個聚酮（PKS）、非核糖體肽類（NRPS）、雜合聚酮-多肽（PKS-NRPS）、萜類（terpene）、硫肽類（lantibiotic）等次級代謝產(chǎn)物，其中只有井岡霉素和環(huán)噻唑霉素合成基因簇得到確認(rèn)。另外，我們重建了井岡霉素合成前體相關(guān)的初級代謝通路，碳源前體為7-磷酸景天庚酮糖和UDP-葡萄糖，氮源前體可能為谷氨酸。分析發(fā)現(xiàn)5008存在兩個UDP-葡萄糖合成酶的編

5、碼基因（ugp），用于提供糖基合成井岡霉素，而其它已測序的鏈霉菌只編碼一個ugp。
　　第二部分，井岡霉素生物合成溫度調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組研究
　　通過基因組芯片技術(shù)，我們分析了5008在30℃與37℃條件下的轉(zhuǎn)錄譜變化，在37℃分別有701個上調(diào)和841個下調(diào)的差異表達(dá)基因。鑒于阿維鏈霉菌NRRL8165與5008有著更多的同源基因，且不存在抗生素合成的溫度調(diào)控現(xiàn)象，我們開展了在同樣發(fā)酵條件下的NRRL8165轉(zhuǎn)錄組分析，在37℃

6、下分別有422個上調(diào)和611個下調(diào)的差異轉(zhuǎn)錄基因。除去共同的差異表達(dá)基因并在更嚴(yán)謹(jǐn)參數(shù)的篩選下，5008分別有122個上調(diào)和237個下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中具有更多的顯著下調(diào)基因。
　　在次級代謝中，除了糖基轉(zhuǎn)移酶 ValG、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ValH和雙組份調(diào)控蛋白ValPQ外，井岡霉素基因簇中其它基因的轉(zhuǎn)錄水平有著4-23倍的顯著上調(diào)，另外還發(fā)現(xiàn)有3個次生代謝合成基因簇的整體轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著上

7、調(diào)。在初級代謝中，第一，糖酵解中6-磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和丙酮酸激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平略有下調(diào)，同時葡萄糖酸激酶和檸檬酸裂解酶顯著上調(diào)，這暗示37℃發(fā)酵條件下糖酵解和三羧酸循環(huán)的代謝速率降低，碳代謝流量發(fā)生改變并更多地進(jìn)入到磷酸戊糖途徑。第二，一些關(guān)鍵氮代謝基因，如谷氨酰胺合成酶GlnA和氮代謝調(diào)控蛋白GlnR，在37℃是顯著下調(diào)的，而催化2-酮戊二酸生成谷氨酸的谷氨酸脫氫酶是上調(diào)的，這暗示5008在37℃時處在高濃度谷氨酸環(huán)

8、境下。進(jìn)一步利用氨基酸分析儀發(fā)現(xiàn)5008胞內(nèi)谷氨酸濃度在37℃時僅有30℃的十分之一，而谷氨酰胺的濃度較為接近，這暗示谷氨酸作為氮代謝前體在37℃條件下主要用于合成井岡霉素。
　　在22個顯著差異轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)基因中，一個SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因SHJG0322的轉(zhuǎn)錄展現(xiàn)出最高的溫度敏感性（128倍）。該基因缺失突變株JG27在30℃條件下井岡霉素產(chǎn)量接近于菌株5008，而在37℃條件下其產(chǎn)量不到5008的20％。轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果顯示va

9、lA和valK在37℃分別上調(diào)了100倍和26倍，而在JG27中都只上調(diào)了6倍。分別使用紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動子和天然啟動子控制下的SHJG0322對JG27進(jìn)行回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)菌株在37℃條件下產(chǎn)量都上升到5008的80%以上。這表明SHJG0322作為正調(diào)節(jié)基因參與了井岡霉素合成的溫度調(diào)控。
　　第三部分基于比較組學(xué)的井岡霉素高產(chǎn)機(jī)制解析
　　我們進(jìn)一步測定了工業(yè)菌株TL01的基因組序列，其染色體大小為9.84 Mb，比菌株

10、5008小305.76 kb。主要差別在于靠近染色體左臂的三個大片段的缺失，大小分別為78.98 kb、144.01 kb和79.63 kb，共編碼了234個蛋白，其中有61個轉(zhuǎn)座酶、18個調(diào)控蛋白、16個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、28個水解酶和56個未知功能蛋白。我們在5008中分別敲除了這三個區(qū)域，其產(chǎn)量從4.7克/升分別提高到7.5克/升、7.6克/升和13.9克/升。在同時缺失三個區(qū)域的多重突變株中，產(chǎn)量繼續(xù)提高到14.9克/升，接近工業(yè)菌株產(chǎn)

11、量的80%以上。
　　另外，兩個基因組中還存在33個InDel和90個SNV位點(diǎn)，除了在井岡霉素結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)，還位于78個已知功能基因（編碼了18個轉(zhuǎn)錄因子、39個初級代謝相關(guān)酶和8個轉(zhuǎn)運(yùn)/膜蛋白等）和24個未知功能基因的內(nèi)部或上游區(qū)域。第一，在工業(yè)菌株井岡霉素基因簇中，反向排布的valABC與valKLMN操縱子之間存在137 bp缺失；第二，對其中的7個調(diào)節(jié)基因進(jìn)行敲除，突變株產(chǎn)量都有不同程度的提高（5.6-13.3 g/L

12、），表明發(fā)生遺傳變異的調(diào)節(jié)基因降低了對井岡霉素合成的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控作用；第三，初級代謝中關(guān)鍵酶（檸檬酸合成酶、尿黑酸雙加氧酶和乙酰/丙酰-CoA羧化酶）發(fā)生遺傳突變降低了三羧酸循環(huán)的代謝速率，使得工業(yè)菌株代謝流量發(fā)生變化。
　　井岡霉素高產(chǎn)是其產(chǎn)生菌基因組和外界發(fā)酵環(huán)境相互作用的結(jié)果，除了研究5008在30℃和37℃條件下的轉(zhuǎn)錄譜變化，我們還開展了5008和TL01分別在低產(chǎn)普通發(fā)酵培養(yǎng)基（YMG）和高產(chǎn)工業(yè)培養(yǎng)基（IND）中的轉(zhuǎn)錄組分

13、析。TL01相比5008在YMG和IND條件下分別有942個和1772個差異表達(dá)基因（DEGs）。然而相比YMG，5008和TL01在IND條件下的DEGs分別達(dá)到5314個和4761個，顯示出不同培養(yǎng)基對基因表達(dá)的巨大擾動。
　　不考慮培養(yǎng)基變化，TL01相比5008有282個共同的DEGs，其中僅有萜類和環(huán)噻唑霉素基因簇的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。而在糖異生途徑中兩個關(guān)鍵酶果糖1,6-二磷酸和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶平均分別上調(diào)5.1倍和16

14、.8倍。另外，共同下調(diào)的131個DEGs中絕大多數(shù)由三個缺失區(qū)域與線型質(zhì)粒編碼。有趣的是，相比5008，TL01僅在IND條件下出現(xiàn)染色體區(qū)域性的轉(zhuǎn)錄譜變化，即在染色體左末端到大片段缺失區(qū)域III這一段接近1.9 Mb的區(qū)域內(nèi)，只有井岡霉素和PKS-II型的基因簇是轉(zhuǎn)錄上調(diào)，其余都是轉(zhuǎn)錄下調(diào)的，線型質(zhì)粒編碼基因顯著下調(diào)，同時脈沖場電泳發(fā)現(xiàn)線型質(zhì)粒在 TL01中有著更低拷貝。不考慮菌株變化，相比YMG培養(yǎng)環(huán)境，在IND條件下有3749個共

15、同的DEGs，其中井岡霉素合成基因的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，平均提高超過100倍。另外，我們還發(fā)現(xiàn)線型質(zhì)粒和環(huán)型質(zhì)?；蛟贗ND條件下都是顯著上調(diào)的。
　　因此，菌株（遺傳）變化可選擇性地調(diào)節(jié)基因組的轉(zhuǎn)錄，使得一些消耗能量的區(qū)域（如線型質(zhì)粒和一些染色體非必需區(qū)域）轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，同時少量初級代謝基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生顯著變化使其代謝流發(fā)生轉(zhuǎn)向，有利于井岡霉素的合成。而培養(yǎng)基（環(huán)境）改變對菌株影響更大，相應(yīng)地帶來更多能量，除了顯著誘導(dǎo)激活井岡霉素合成基因

16、外，還可以保證其內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行高效復(fù)制。
　　第四部分組學(xué)分析基礎(chǔ)上的井岡霉素工業(yè)菌株的正向工程改造
　　基于以上組學(xué)分析，我們考慮初步從系統(tǒng)的水平改造工業(yè)菌株 TL01。一方面利用Cre-LoxP的特異性重組系統(tǒng)對在 TL01中整體轉(zhuǎn)錄下調(diào)的大片段區(qū)域進(jìn)行了缺失，突變株產(chǎn)量沒有顯著提高，但生長較為迅速，積累了更多生物量，表明該菌株代謝更為旺盛。另一方面，通過高溫與超低濃度的SDS聯(lián)用方法將線型質(zhì)粒進(jìn)行消除。首先對菌株5008

17、進(jìn)行線型質(zhì)粒消除，得到的兩個突變株產(chǎn)量都有明顯增加，分別提高了48.6%與37.2%。隨后，進(jìn)一步對工業(yè)菌株TL01進(jìn)行線型質(zhì)粒消除，其產(chǎn)量從18.4克/升提升到突變株的22.2克/升，提高了20%以上。
　　綜上所述，本論文通過比較基因組、轉(zhuǎn)錄組分析并結(jié)合經(jīng)典的遺傳操作成功揭示了井岡霉素高產(chǎn)的分子機(jī)理，在此基礎(chǔ)上定向改造現(xiàn)有工業(yè)菌株，初步實(shí)現(xiàn)了超高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建，為進(jìn)一步理性改良井岡霉素產(chǎn)生菌與優(yōu)化其生產(chǎn)工藝奠定了理論基礎(chǔ)，同時