豬LMP2、LMP7和MECL-1基因的分子特征及與免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、本研究通過電子克隆和RT-PCR首次獲得了豬LMP2、MECL-1基因的全長cDNA序列，LMP2基因全長為903bp (GenBank注冊(cè)號(hào)：DQ295031)，含有一個(gè)661bp的完整開放閱讀框，編碼219個(gè)氨基酸。MECL-1基因序列全長985bp(GenBank注冊(cè)號(hào)：DQ444460)，包含一個(gè)822bp的開放閱讀框，編碼274個(gè)氨基酸。BLAST軟件進(jìn)行同源性分析表明豬LMP2基因與人、小鼠、大鼠基因相似性分別為88.6％、

2、83.2％、80.1％；豬MECL-1基因序列與人、小鼠、牛的基因序列分別有82.6％、76.2％、89.2％的相似性。 通過Q-PCR和．RT-PCR定量方法，檢測了豬LMP2、MECL-1基因的組織表達(dá)譜，結(jié)果表明LMP2基因在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺、小腸、胸腺、淋巴結(jié)、大腦9種組織中均表達(dá)，但在肌肉中無表達(dá)外；MECL-1基因在以上10種組織中均有表達(dá)。利用RH輻射雜交板將豬LMP2基因定位在豬7號(hào)染色體的7q1.1區(qū)

3、域，與微衛(wèi)星SW472緊密連鎖(LOD=8.71，47cR)；MECL-1基因定位在豬6號(hào)染色體上，與微衛(wèi)星SW1108緊密連鎖(LOD=4.09，84cR)。 將豬LMP2、LMP7基因cDNA序列在GenBank中比對(duì)，獲得了一個(gè)豬DNA序列克隆BX323833.4，比較分析后確定這兩個(gè)基因內(nèi)含子與外顯子的分界點(diǎn)，以兩端外顯子設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)含子的上下游引物，最終獲得了LMP2基因5090bp的基因組序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：D

4、Q659151)和LMP7基因2995bp的基因組序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：D0872631)。豬LMP2基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，豬LMP7基因含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。 本課題以長白豬(83)、大白豬(195)和松遼黑豬(89)共計(jì)367頭仔豬為研究對(duì)象，檢測了三群體在20日齡、35日齡的血常規(guī)、淋巴細(xì)胞亞群等免疫指標(biāo)，并采用SSCP方法篩選了LMP2、LMP7兩基因所有外顯子及部分內(nèi)含子區(qū)域，期望尋找到影響這些免

5、疫性狀的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs，其中5個(gè)為同義突變，1個(gè)為錯(cuò)義突變。運(yùn)用SAS軟件包中的混合模型對(duì)基因多態(tài)位點(diǎn)與免疫性狀的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMP7基因外顯子3上SNP位點(diǎn)(LMP7-3)與20日齡CD4<'->CD8<'+>相關(guān)顯著；LMP2基因外顯子5上SNP位點(diǎn)(LMP2-5)與35日齡CD4<'+>CD8<'+>、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞壓積相關(guān)顯著；LMP2基因外顯子2上位點(diǎn)(LMP2-2)

6、與35日齡白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞百分率、單核細(xì)胞百分率、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞體積分布寬度；LMP7基因外顯子3上SNP位點(diǎn)(LMP7-3)與35日齡粒細(xì)胞含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)顯著：LMP7基因內(nèi)含子6上SNP位點(diǎn)(LMP7-6)與35日齡紅細(xì)胞體積分布寬度相關(guān)顯著；LMP2-2與兩次測定的紅細(xì)胞平均體積籌值、紅細(xì)胞體積分布寬度差值相關(guān)顯著；LMP7-3與兩次測定的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)差值、紅細(xì)胞體積分布寬度差值相關(guān)顯著；LMP7-6與兩次測定的紅