EBV-LMP2多表位肽免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、目的： 1.預(yù)測和篩選EBV-LMP2多表位肽：預(yù)測EB病毒(EBV)潛伏膜蛋白2(LMP2)的CTL和Th細(xì)胞表位，選擇評(píng)分較高的CTL和Th表位，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室預(yù)測的EBV-LMP2 B細(xì)胞表位[1]，獲得EBV-LMP2多表位肽序列。 2.EBV-LMP2多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表達(dá)和純化：構(gòu)建含EBV-LMP2多表位肽的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用Wester

2、n blot進(jìn)行特異性鑒定。采用Ni-NTA樹脂親和層析法純化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽。同時(shí)純化pET32a(+)表達(dá)的His蛋白用于動(dòng)物免疫和ELISA檢測的對(duì)照研究。 3.利用小鼠檢測EBV-LMP2多表位肽的免疫原性：將純化的EBV-LMP2多表位肽和His蛋白分別免疫BALB/c小鼠，隔周免疫，共3次。采用ELISA方法分析免疫后小鼠血清IgG及陰道分泌物sIgA水平及維持時(shí)間，并采用EBV抗原(B95-8細(xì)胞制

3、備)作為陽性對(duì)照。同時(shí)，在末次免疫后1w無菌取小鼠脾細(xì)胞用LDH釋放法進(jìn)行CTL殺傷活性分析，以檢測EBV-LMP2多表位肽免疫小鼠后誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫效應(yīng)。本研究初步分析了EBV-LMP2多表位肽免疫原性，為EBV感染相關(guān)疾病的表位疫苗設(shè)計(jì)及研制相關(guān)診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。 方法： 1.以EBV標(biāo)準(zhǔn)株(B95-8細(xì)胞)LMP2的完整氨基酸序列(497aa)為基礎(chǔ)，應(yīng)用在線預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI(http：//www.

4、syfpeithi.de/)，預(yù)測EBV-LMP2的H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501等限制性表位，尤其是HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd重疊的區(qū)域，選擇含CTL、Th表位富集的肽段。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道的EBV-LMP2 B細(xì)胞表位[1]，選擇B細(xì)胞表位及CTL、Th細(xì)胞表位富集的肽段作為多表位肽的候選序列。

5、 2.將EBV-LMP2多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并將其插入原核質(zhì)粒pET32a(+)，構(gòu)建含有His標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，并用Western blot鑒定其免疫原性，用Ni-NTA樹脂親和層析法純化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽及His蛋白。 3.選擇6～8周齡雌性BALB/c小鼠，分3組，即EBV-LMP2多

6、表位肽組、His蛋白組及PBS組，每組9只。將純化后的融合蛋白EBV LMP2多表位肽及His蛋白與佐劑等體積混勻后按照50μg/只劑量分別免疫小鼠，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后1w斷尾取血并收集陰道分泌物，采用ELISA法檢測血清中特異性IgG和陰道分泌物中特異性sIgA水平。同時(shí)，于術(shù)次免疫后1w，每組隨機(jī)取3只小鼠，無菌取脾臟，制備脾細(xì)胞進(jìn)行CTL細(xì)胞特異性殺傷活性檢測，采用乳酸脫氫酶LDH釋放法檢

7、測其特異性細(xì)胞免疫效應(yīng)。其余小鼠持續(xù)檢測其特異性血清IgG和陰道分泌物特異性sIgA的持續(xù)水平直至第7w。 結(jié)果： 1.從SYFPEITHI網(wǎng)站預(yù)測到的候選CTL和Th表位中選擇出19條評(píng)分較高的肽段，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)預(yù)測的EBV-LMP2 B細(xì)胞表位[1]，選擇CTL和Th細(xì)胞富集的肽段，即EBV-LMP2195-232和EBV-LMP2419-435肽段，將兩段序列串聯(lián)，即得到EBV-LMP2多表位肽序列。

8、2.酶切鑒定和核苷酸測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有EBV-LMP2多表位肽的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。SDS-PAGE分析，在37℃，1.0mM IPTG作用下誘導(dǎo)6hr能很好地表達(dá)目的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為27kDa，與預(yù)期Mr大小吻合；蛋白表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白量的23％。Western Blot結(jié)果顯示，以HRP標(biāo)記的小鼠抗His-IgG(H+L)作為一抗，則可見單一明顯條帶，與SDS-PAGE

9、中位置吻合。用Ni-NTA樹脂親和層析法分別純化得到表位融合蛋白EBV-LMP2多表位肽和pET32a(+)所表達(dá)的His蛋白。 3.BALB/c小鼠經(jīng)融合蛋白EBV-LMP2多表位肽免疫后，可獲得高效價(jià)的血清特異性IgG。血清抗體效價(jià)隨免疫次數(shù)增加而升高，自第1w開始升高，可持續(xù)至第7w。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被并將血清按1：100稀釋，檢測第7w小鼠IgG抗體水平：EBV-LMP2多表位肽組A值為(1.17

10、8±0.130)，His蛋白組及PBS組分別為(0.468±0.121)，(0.016±0.008)； EBV-LMP2多表位肽組分別與His蛋白組及PBS組相比，均有顯著性差異(P<0.05)； His蛋白組與PBS相比也有顯著性差異(P<0.05)。 4.三組小鼠陰道分泌物特異性sIgA自第3w開始升高，至第5w達(dá)到高峰，然后下降。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被檢測第5w小鼠sIgA抗體水平：EBV-LMP2多表

11、位肽組A值為(0.754±0.064)，His蛋白組和PBS組分別為(0.455±0.038)，(0.171±0.018)； EBV-LMP2多表位肽組分別與His蛋白組及PBS組相比，均有顯著性差異(P<0.05)； His蛋白組與PBS相比也有顯著性差異(P<0.05)。 5.免疫小鼠CTL特異性的殺傷活性結(jié)果顯示，隨著效靶比的增加，EBV-LMP2多表位肽組的特異性殺傷率逐漸升高。效靶比為5：1、10：1、25：1時(shí)，EB

12、V-LMP2多表位肽組的殺傷率分別為(12.52±2.59)％、(21.80±1.080)％和(23.68±3.74)％，His蛋白組和PBS組相應(yīng)效靶比殺傷率分別為(3.72±1.18)％，(4.35±0.85)％，(7.15±2.09)％和(2.29±1.05)％，(4.12±0.42)％，(4.93±0.10)％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，效靶比為5：1，10：1和25：1時(shí)，EBV-LMP2多表位肽組與His蛋白組和PBS組相比均有顯著性差差

13、異P<0.05)，而His蛋白組和PBS組相比則無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.預(yù)測并篩選了19個(gè)可能的EBV-LMP2的CTL表位和Th表位，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)預(yù)測的B細(xì)胞表位[1]，確定了EBV-LMP2多表位肽序列。 2.通過分子克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了含EBV-LMP2多表位肽的重組質(zhì)粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽；在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了多表位蛋白EBV-LMP2多表位肽；通過親和層析

14、法得到了純化的EBV-LMP2多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫BALB/c小鼠的血清學(xué)檢測結(jié)果表明，EB V-LMP2多表位肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生全身及局部的特異性抗體：血清特異性抗體IgG效價(jià)隨免疫次數(shù)增加而升高，自第1w開始升高，可持續(xù)至第7w；陰道分泌物特異性sIgA自第3w開始升高，到第5w達(dá)高峰，然后下降。 4.乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CTL特異性殺傷結(jié)果顯示，EBV-LMP2多表位肽可以刺激機(jī)體產(chǎn)