Slit-Robo信號在口腔癌和粘液表皮樣癌中的作用機(jī)理研究.pdf

1、Slit蛋白是對軸突生長和神經(jīng)元遷移起導(dǎo)向作用的軸突定向分子家族成員之一，它通過其受體家族Roundabout(Robo)作為神經(jīng)軸突導(dǎo)向和神經(jīng)元遷移的排斥性因子以及白細(xì)胞趨化的抑制因子發(fā)揮重要的作用。已有研究證實在多種實體瘤中均有Slit-2蛋白的表達(dá)，Robol表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且Slit-Robo信號可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間“對話”機(jī)制，從而參與了腫瘤新生血管的形成，這為抑制腫瘤的生長提供了新的分子靶點。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中

2、腫瘤細(xì)胞相互之間的“信息通訊”也是十分重要的，新近的研究發(fā)現(xiàn)Slit-Robo信號在腫瘤細(xì)胞之間有著一定的調(diào)控功能，特別是在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程中有著重要的作用。本課題是在Slit-Robo信號介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間“對話”機(jī)制及其調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制的研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探討Slit-Robo信號對口腔癌的發(fā)生發(fā)展是否同樣有著重要作用，并以該信號是否通過調(diào)控口腔癌成癌過程中血管生成而參與口腔癌癌變?yōu)檠芯恐攸c，探討Slit-Robo

3、信號在口腔癌形成中的作用機(jī)制；同時通過另一口腔常見的涎腺惡性腫瘤細(xì)胞，并以該信號是否通過調(diào)控該腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡從而參與腫瘤的形成過程為研究重點，探討Slit-Robo信號是否廣泛參與了腫瘤細(xì)胞之間的“對話”，再次去證實腫瘤形成中這一新的分子機(jī)制。 為了探討以上問題，我們選用了口腔癌成癌過程中各階段人組織標(biāo)本作為研究對象，口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤，正?？谇徽衬ば杞?jīng)過粘膜單純增生、粘膜異常增生及原位癌階段最終發(fā)展成為口腔鱗

4、癌。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測了口腔粘膜癌變過程中Slit2蛋白及Robol蛋白的表達(dá)，并同時檢測VEGF的表達(dá)和腫瘤微血管密度(MVD)，重點觀察Slit2蛋白在口腔癌成癌各階段中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系。同時我們選用了人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移Mc3細(xì)胞系為研究對象，人涎腺粘液表皮樣癌是口腔最為常見的惡性腫瘤之一，人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移Mc3細(xì)胞系為MEC-1肺轉(zhuǎn)移亞系，它保持了粘液表皮樣癌的組織學(xué)特征，具有生長較快，S期細(xì)胞

5、比例增高，接觸抑制力下降，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等特點。本研究采用Slit-Robo信號特異性阻斷性抗體R5為干預(yù)手段，觀察Mc3細(xì)胞在R5抗體作用下增殖、凋亡能力的改變。 本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果：一、臨床標(biāo)本Slit2、Robo1蛋白、VEGF及vWF的表達(dá)研究1、通過免疫組織化學(xué)方法檢測Slit2蛋白表達(dá)，證實在正?？谇徽衬ぁ⑸掀渭冊錾衬?、上皮異常增生粘膜、原位癌組織、鱗癌組織的Slit2蛋白均有表達(dá)并且依次增高，并且從上皮異常增生

6、粘膜開始Slit2蛋白表達(dá)與正常粘膜相比有明顯增加，當(dāng)癌細(xì)胞突破基底膜進(jìn)入固有層形成浸潤性癌時，Slit2蛋白表達(dá)無論在陽性細(xì)胞數(shù)量或強(qiáng)度方面均達(dá)到了高峰，說明Slit信號在上皮異常增生時開始啟動，并隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展逐步增加，在原位癌時有了較明顯表達(dá)，在浸潤癌時出現(xiàn)了較強(qiáng)的瀑布式的表達(dá)，提示Slit信號與口腔癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。 2、Robo1蛋白在口腔粘膜癌變過程中的表達(dá)口腔粘膜癌變過程中Robo1蛋白的表達(dá)比較弱且分布無

7、明顯特征，各組間表達(dá)亦無明顯規(guī)律，口腔鱗癌組陽性表達(dá)例數(shù)較多，可見多數(shù)癌細(xì)胞Robo1蛋白弱表達(dá)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)，部分炎細(xì)胞也呈陽性染色。口腔鱗癌組與正常粘膜組、上皮單純增生組、上皮異常增生組及原位癌組間差異無顯著性。 3、通過免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF蛋白表達(dá)，證實在口腔粘膜癌變過程中VEGF的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與Slit2蛋白陽性表達(dá)趨勢上是一致的，呈顯著性正相關(guān)，隨著口腔粘膜癌變過程的發(fā)展表達(dá)均逐漸增強(qiáng)，自異常增生

8、組開始與正常粘膜組間即有了顯著性差異，鱗癌組兩者均達(dá)到高峰。說明Slit2蛋白可能打開了血管生成表型的開關(guān)，通過新生血管的形成加速癌前病變向癌的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，這在口腔癌血管生成機(jī)制中可能具有重要意義。 4、通過免疫組織化學(xué)方法檢測vonWillebrand'sfactor(vWF)表達(dá)，通過vWF對血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性染色，計數(shù)腫瘤微血管密度(MVD)。本實驗證實MVD是隨著腫瘤惡性程度的升高而增加，并在原位癌發(fā)生了質(zhì)的改變，鱗癌達(dá)到

9、高峰。MVD與Slit2蛋白表達(dá)及VEGF表達(dá)均呈顯著性正相關(guān)，這是血管形成適應(yīng)腫瘤快速生長的結(jié)果，同時也說明了Slit2蛋白與腫瘤新生血管形成有著密切的關(guān)系。 二、Slit-Robo信號在人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移Mc3細(xì)胞系增殖、凋亡中的功能研究1、通過免疫組織化學(xué)證實Mc3細(xì)胞同樣表達(dá)Slit2、Robo1蛋白，再次證實在常見的人涎腺惡性腫瘤中Slit-Robo信號同樣可能參與了腫瘤細(xì)胞之間的“對話”。 2、通過R5

10、抗體作用于Mc3細(xì)胞，采用MTT比色法、軟瓊脂克隆形成實驗以及流式細(xì)胞儀細(xì)胞內(nèi)抗原檢測法檢測PCNA蛋白的表達(dá)，證明Slit-Robo信號可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖來影響腫瘤的發(fā)生。 3、通過R5抗體作用于Mc3細(xì)胞，采用FITC-AnnexinV/PI檢測法檢測R5抗體組的凋亡細(xì)胞發(fā)生率達(dá)到33.6％；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，Mc3細(xì)胞復(fù)制停滯于S期；并且DNA電泳顯示清晰的DNALadder；Hoechst/PI雙染法觀察

11、各組正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞的差異；以流式細(xì)胞儀細(xì)胞內(nèi)抗原檢測法檢測R5抗體作用下細(xì)胞caspase-3蛋白的含量，同對照組相比明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果均證實了R5抗體作用后的Mc3細(xì)胞增殖與凋亡之間保持著一定的動態(tài)平衡狀態(tài)，Slit-Robo信號可能以抑制細(xì)胞凋亡的形式參與了腫瘤的形成過程，而caspase-3蛋白可能是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 本研究的結(jié)果表明：口腔鱗癌癌變過程中Slit2蛋白陽性表達(dá)與其惡性程度呈正相關(guān)，并且