MRP1參與粘液表皮樣癌多藥耐藥機制的研究.pdf

1、無論是西方世界還是中國,粘液表皮樣癌都是口腔以及頭頸部最常見的原發(fā)性唾液腺腫瘤[1,2,3]。粘液表皮樣癌占唾液腺所有腫瘤的10％,占唾液腺惡性腫瘤的35%[4]。在兒童患者中,粘液表皮樣癌更是占到了唾液腺所有腫瘤的16%,占唾液腺惡性腫瘤的51%[5]。根據(jù)腫瘤形態(tài)和腫瘤細胞特征,粘液表皮樣癌分為高度惡性粘液表皮樣癌,中度惡性粘液表皮樣癌,低度惡性粘液表皮樣癌。中度惡性粘液表皮樣癌和低度惡性粘液表皮樣癌一般情況下生存率很高,然而高度惡

2、性粘液表皮樣癌一般情況下預后很差,其五年生存率僅有30%左右[6,7]。粘液表皮樣癌通常對化療及放療均不敏感,手術(shù)切除一直是粘液表皮樣癌的標準治療方法,化療僅用于無法完全切除的粘液表皮樣癌患者或者已經(jīng)遠端轉(zhuǎn)移的粘液表皮樣癌患者,即便是這樣,粘液表皮樣癌患者的化療預后仍然不甚理想[8],并且頭頸部的腫瘤切除總會給患者帶來難以恢復的頭頸部疤痕和面部缺陷,極大的影響了患者的生活質(zhì)量并給患者帶來極大的心理創(chuàng)傷。因此提高粘液表皮樣癌的化療療效成為

3、當務之急。本研究的目的就是通過研究粘液表皮樣癌的耐藥機制,找出粘液表皮樣癌耐藥的原因,從而為日后針對粘液表皮樣癌的治療打下堅實的基礎。
　　多藥耐藥相關(guān)蛋白(MPR1或ABCC1)一直以來被認為是一個膜結(jié)合,能量依賴的蛋白轉(zhuǎn)運子。隸屬于ABC轉(zhuǎn)運通道蛋白家族。多藥耐藥蛋白(MDR1或ABCB1)被首次發(fā)現(xiàn)后,所有人都認為找到了治療腫瘤耐藥的關(guān)鍵分子,認為多藥耐藥蛋白MDR1就是引起腫瘤耐藥的唯一轉(zhuǎn)運蛋白。然而,在一個多藥耐藥小細胞

4、肺癌細胞系中[9]卻發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白(MDR1或ABCB1)沒有過表達,過表達的是另一種轉(zhuǎn)運蛋白—多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1,這是MRP1的首次發(fā)現(xiàn)。之后,大量報道發(fā)現(xiàn)MRP1的過表達可以預測多種血液和實體瘤化療的不良預后[10]。在腫瘤細胞中,盡管MRP1也被發(fā)現(xiàn)與細胞質(zhì)中,但MRP1主要位于細胞膜上也表明將藥物從細胞內(nèi)泵到細胞外是MRP1導致多藥耐藥中的主要原因[11,12,13,14,15,16]。在正常組織中,MRP1主要位于細胞

5、基底外側(cè)面,用來將底物排入血液中[17]。MDR1和MRP1都屬于ATP結(jié)合蛋白超家族成員,并且都是和多藥耐藥高度相關(guān)的蛋白。人類MDR1在染色體7q21上,跨度100kb;人類MRP1在染色體16p13.1上,跨度為194kb,兩基因氨基酸序列相似度僅為15%。MDR1底物通常為中性疏水藥物或帶陽性電荷的疏水藥物,而MRP1的底物通常為中性疏水藥物或帶陰性電荷的疏水藥物。與MDR1不同的是,MRP1也可以轉(zhuǎn)運谷胱甘肽及谷胱甘肽的藥物結(jié)

6、合物[18]。雖然對MRP1的研究很多,但是MRP1的晶體結(jié)構(gòu)和它的轉(zhuǎn)運機制仍然不甚明了[19],并且腫瘤中的MRP1由于其廣泛存在基因多態(tài)性和變異,使得MRP1的功能更加難以預測[20,21].
　　本次研究中,我們在粘液表皮樣癌細胞中首次發(fā)現(xiàn)了核MRP1的存在,并證明了MRP1的核轉(zhuǎn)運和粘液表皮樣癌的多藥耐藥的相關(guān)性。為研究MRP1在粘液表皮樣癌細胞中是如何發(fā)揮多藥耐藥作用的,我們利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)MRP1表達,并發(fā)現(xiàn)MD

7、R1的表達也相應的下降了。我們通過免疫組化技術(shù)檢測了MDR1和MRP1在127例粘液表皮樣癌患者腫瘤樣本中的的蛋白表達,也發(fā)現(xiàn)二者之間的正相關(guān)關(guān)系。通過免疫組化檢測組織芯片,發(fā)現(xiàn)MRP1的核表達并未在其他正常組織和腫瘤組織中出現(xiàn)。為了證明MDR1的下調(diào)確實是由MRP1的下調(diào)引起,我們通過熒光素酶報告分析技術(shù)最終證明了MRP1下調(diào)后,通過改變MDR1基因啟動子的活性,從而引起MDR1的表達量改變。綜上所述,我們認為MRP1的新功能可能為將

8、來粘液表皮樣癌的臨床個體化治療提供新的靶點。
　　第一部分 MRP1下調(diào)引起粘液表皮樣癌多藥耐藥細胞系耐藥性下降
　　目的:研究MRP1在粘液表皮樣癌多藥耐藥中所發(fā)揮的作用。
　　材料和方法:高轉(zhuǎn)移粘液表皮樣癌細胞系MC3和由其使用五氟尿嘧啶沖擊療法誘導而出的多藥耐藥細胞系MC3/5FU由本實驗室建系并保存。合成針對MRP1的shRNA,并篩選出被其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MC3/5FU細胞系。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

9、來檢測RNA的表達,蛋白質(zhì)印跡(Western blot)用來檢測蛋白表達的改變。甲基噻唑基四唑試驗(MTT assay)用來檢測細胞生長和細胞耐藥性的改變。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL staining)用來檢測細胞凋亡。數(shù)據(jù)結(jié)果使用Student’s t-test and one-way ANOVA(LSD)來計算對比實驗組與對照組之間的差異顯著性。計算由統(tǒng)計軟件SPSS version12.0完

10、成。P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:MRP1的下調(diào)顯著提高了多藥耐藥細胞系MC3/5FU的對五氟尿嘧啶(5FU),阿霉素(ADM),表阿霉素(PADM),博來霉素-A5(BLM-A5),順鉑(CDDP)和紫杉醇(TAX)的化學敏感性,在一定5FU濃度下,MRP1的下調(diào)顯著抑制了MC3/5FU細胞的生長并顯著增加了其凋亡。
　　結(jié)論:MRP1在粘液表皮樣癌的多藥耐藥中發(fā)揮著重要作用。
　　第二部分.MRP1的核轉(zhuǎn)位

11、參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性改變
　　目的:檢測MRP1的核轉(zhuǎn)移是否與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性的改變相關(guān)。
　　材料和方法:免疫熒光細胞化學染色法進行細胞染色后,使用激光共聚焦顯微鏡用來檢測MRP1的亞細胞分布。免疫熒光組織化學法來檢測MRP1在粘液表皮樣癌腫瘤組織中和正常腮腺組織中的表達以及定位,并通過免疫化學組織染色法來對組織芯片染色,從而檢測MRP1在其他正常組織和其他腫瘤組織中的表達和定位。Student’s t-t

12、est and one-way ANOVA(LSD)用來計算對比改變的顯著性以及實驗組和對照組之間的差異。計算由統(tǒng)計軟件SPSS版本12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:通過聚合酶鏈反應和免疫印跡的方法,在RNA以及蛋白水平,對比MRP1在多藥耐藥細胞系MC3/5FU中和其親代細胞MC3中的表達,我們發(fā)現(xiàn)MRP1的表達并沒有發(fā)生量的變化。但是當我們下調(diào)MRP1在MCA/5FU細胞中的表達后,細胞的多藥耐藥性卻明顯下降

13、了。免疫熒光細胞化學染色進行蛋白定位后發(fā)現(xiàn)MRP1從MC3細胞的細胞膜及細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到了MC3/5FU細胞的細胞核中,而且MC3/5FU細胞中下調(diào)的MRP1主要為細胞核中的MRP1。為檢測核MRP1是否也出現(xiàn)在其他組織或者腫瘤中,也為了檢測是否為MRP1的一抗的非特異性染色才使得MRP1出現(xiàn)在細胞核中,我們用相同的一抗對組織芯片在相同條件下進行免疫化學染色,結(jié)果我們并未發(fā)現(xiàn)MRP1在其他正常組織或者腫瘤組織中有核表達。
　　結(jié)論:

14、 MRP1的核轉(zhuǎn)移參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性改變。MRP1的核轉(zhuǎn)移可能是MRP1引發(fā)耐藥的新機制,基于這個新機制可能開發(fā)出新的粘液表皮樣癌治療方法。核MRP1可能為粘液表皮樣癌所特有,其有潛質(zhì)來成為鑒別診斷粘液表皮樣癌的一個Marker。
　　第三部分下調(diào)MRP1的表達導致MDR1表達的下降
　　目的:研究核MRP1是通過何種機制來參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥的。
　　材料和方法:從第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院病理科收集127

15、例常規(guī)手術(shù)治療粘液表皮樣癌患者的腫瘤組織樣本,患者手術(shù)時間均在2006年至2011年。用免疫組織化學染色來檢測MRP1和MDR1在粘液表皮樣癌組織中的的表達。染色程度由蔡卜磊博士和劉園博士分別檢測。結(jié)果通過定性的方法結(jié)合定量的方法檢測。為排除MRP1表達在細胞核膜上的可能性,利用激光共聚焦顯微鏡進行分層掃描進行蛋白定位。RT-PCR用來檢測RNA表達量的改變。Western blot用來檢測蛋白表達的改變。Student’s t-tes

16、t and one-way ANOVA(LSD)用來計算對比改變的顯著性。斯皮爾曼等級相關(guān)分析來分析MDR1表達量和MRP1表達量的相關(guān)性。計算由統(tǒng)計軟件SPSS version12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:為了排除MRP1一抗特異性的問題,我們從另一家公司購買了新的MRP1一抗來進行免疫組織化學染色,結(jié)果我們再次確認MRP1出現(xiàn)在粘液表皮樣癌的細胞核中。聚合酶鏈反應以及免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn),在下調(diào)MRP1的表

17、達后,MDR1的表達也明顯降低。通過分析127例粘液表皮樣癌患者的腫瘤樣本相同位置的MRP1表達和MDR1表達及定位,再次確認發(fā)現(xiàn)MRP1的表達量與MDR1的表達量有明顯正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:在粘液表皮樣癌腫瘤中MRP1的表達量與MDR1的表達量顯著正相關(guān)。
　　第四部分核MRP1通過降低MDR1啟動子的活性來調(diào)節(jié)MDR1的表達
　　目的:初步探索MRP1對MDR1表達通路中的影響
　　材料和方法:shRNA瞬

18、時轉(zhuǎn)染MC3/5FU細胞系下調(diào)MRP1的表達。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應用來檢測RNA的表達,免疫印跡法用來檢測蛋白表達的改變。熒光素酶報告分析(luciferase reporter assays)檢測MDR1啟動子活性。Student’s t-test and one-way
　　ANOVA(LSD)用來計算對比改變的顯著性。計算由統(tǒng)計軟件SPSS version12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:瞬時轉(zhuǎn)染shR