豬星狀病毒分離鑒定及其全基因組序列分析和衣殼蛋白原核表達(dá).pdf

1、星狀病毒(Astrovirus,AstV)是一類(lèi)可感染人及其他多種動(dòng)物的腸道疾病相關(guān)病原。目前該病毒已經(jīng)從人、豬、牛、蝙蝠、犬、貓等31種哺乳類(lèi)動(dòng)物和雞、火雞、鴨和鴿子等6種禽類(lèi)中檢測(cè)出來(lái),然而星狀病毒感染與動(dòng)物腸道疾病之間的關(guān)系并沒(méi)有得到深入的了解?；蜃儺愋砸言谠S多種動(dòng)物星狀病毒中發(fā)現(xiàn),但是由此產(chǎn)生的抗原性差異僅在人星狀病毒中得到證實(shí)。此外,越來(lái)越多的研究證據(jù)表明星狀病毒之間可以發(fā)生基因重組。由此可知,星狀病毒的多宿主性、基因差異性

2、及其重組現(xiàn)象和跨種間傳播及適應(yīng)新宿主的能力,使得星狀病毒成為潛在的新興人畜共患病原。本研究旨在探究豬星狀病毒的分離培養(yǎng)特性和分析其遺傳變異規(guī)律和衣殼蛋白的抗原特性,從而為進(jìn)一步加深對(duì)豬星狀病毒的了解而提供一定的理論支持和實(shí)踐依據(jù)。
　　本研究采用 RT-PCR檢測(cè)為豬星狀病毒陽(yáng)性的豬糞便上清進(jìn)行病毒分離;在添加胰酶的條件下,分離得到1株能在PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定增殖20代同時(shí)產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE)的豬星狀病毒(PAstV-GX1

3、)毒株,病毒的TCID50為106.22/ml。然而在不添加胰酶條件下,病毒的致細(xì)胞病變能力顯著降低。通過(guò)采用常規(guī)PCR,3′RACE及5′RACE等方法,基本獲得分離毒株的全基因組序列,序列長(zhǎng)6342bp,包括大部分 ORF1a,完整的ORF1b及ORF2,3′非編碼區(qū)和poly(A)尾。全基因組核苷酸序列同源性分析表面,分離株 PAstV-GX1與目前唯一一株 MAstV3型星狀病毒全序列(PAstV-Shanghai)的同源性最高

4、(83.2％),而與其他基因型豬星狀病毒的同源性不到50%。由全長(zhǎng)衣殼蛋白基因ORF2構(gòu)建的遺傳進(jìn)化分析表明,PAstV-GX1與PAstV-Shanghai及其他MAstV3型星狀病毒處于同一分支,與加拿大分離株P(guān)AstV-12-3的親緣性最近,且相比于其他豬星狀病毒毒株,PAstV-GX1與經(jīng)典型人星狀病毒的親緣性最近。此外,核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn),PAstV-GX1基因組存在星狀病毒保守的3個(gè)特殊的核苷酸序列,即核糖體移位序列,亞基因

5、組轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列及基因組3′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列。
　　在由基因組推導(dǎo)的非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),ORF1a的5′端存在5個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu);在nsp1a的aa50及aa500附近存在2個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。衣殼蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),豬星狀病毒 ORF2推導(dǎo)編碼的氨基酸序列存在保守區(qū)和變異區(qū),分別為aa1～aa419和aa420~aa750,并且衣殼蛋白的5′和3′端存在2個(gè)抗原指數(shù)較高的區(qū)域。本研究成功實(shí)現(xiàn)了PAstV-GX1衣殼蛋