降鈣素基因相關肽在頜骨骨折愈合過程中對轉化生長因子-β1的調控作用研究.pdf

1、降鈣素基因相關肽(Calcatonin gene related peptide，CGRP)作為一種肽類神經(jīng)遞質，主要分布在代謝活躍的骨組織中，可調節(jié)骨細胞生長、分化、活性，從而調控骨折愈合過程，但是其具體調控機制目前尚不明確。同時研究發(fā)現(xiàn)轉化生長因子-β(TGF-β)可同時刺激間充質干細胞、軟骨細胞和成骨細胞的增殖及分化，還可以誘導細胞外蛋白質的產(chǎn)生，在軟骨形成期及骨形成改建期發(fā)揮十分重要的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β有五種不同結構為

2、TGF-β1-5，骨折愈合過程中不同結構的TGF-β在不同時間到達表達峰值，發(fā)揮的調控作用也不相同。其中TGF-β1的表達時間最長，TGF-β1與TGF-β2的比例約為4:1，TGF-β1也是目前研究的最多的一個亞結構。
　　 在頜骨骨折愈合過程中，降鈣素基因相關肽是否通過對TGF-β1的調控，促使骨折愈合？本實驗在課題組以往工作的基礎上，建立失下牙槽神經(jīng)支配的下頜骨骨折模型，檢測骨痂中CGRP的分布，進而研究頜骨骨折愈合的骨痂

3、中CGRP的改變對TGF-β1的表達所產(chǎn)生的影響；體外細胞實驗研究中，通過加入外源性CGRP培養(yǎng)成骨細胞，檢測成骨細胞培養(yǎng)液中TGF-β1的表達，研究對成骨細胞的調控作用。
　　 方法：
　　 細胞實驗：觀察CGRP對成骨細胞TGF-β1表達的影響。原代培養(yǎng)新生兔顱骨成骨細胞，對所培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶染色鑒定后，分別向細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的CGRP，分別在不同時間段進行處理，用MTT法檢測成骨細胞生長

4、活力，用western-blot檢測成骨細胞中TGF-β1的蛋白表達。
　　 動物實驗：實驗建立失下牙槽神經(jīng)下頜骨骨折愈合實驗組和單純性下頜骨骨折愈合對照組的實驗動物模型(每組各25只)。兩組動物分別傷后于4d、7d、14d、21d、28d于耳緣靜脈處空氣栓塞致死，截取制備骨折處之骨痂，采用免疫組化方法對觀察愈合情況，運用Western-blot法檢測TGF-β1蛋白表達。
　　 結果：
　　 細胞實驗結果：(1

5、)原代培養(yǎng)并分離兔顱骨成骨細胞，進行堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。(2)外源性地加入同一濃度的CGRP后隨著時間的增加MTT值也呈增加趨勢；(3)同一時間點做比較，隨著CGRP濃度的不斷增加，MTT值也呈上升趨勢，并且在48h和72h組，這種趨勢愈加明顯(P<0.05)。(4)Western blot實驗中隨CGRP濃度的增加TGF-β1條帶灰度顯著升高，顯示TGF-pi蛋白的表達逐漸增強(P<0.05)，CGRP促進兔顱骨成骨細胞TG

6、F-β1的表達。
　　 動物試驗結果：(1)骨痂標本HE染色觀察：單純性骨折對照組可見骨痂組織中新生骨小梁生長速度較快、排列規(guī)則、粗大致密；失下牙槽神經(jīng)實驗組的骨痂中骨小梁稀疏并且排列不規(guī)則、骨痂結構存在缺陷，類骨質及骨吸收空腔較多。(2)TGF-β1免疫組化染色觀察：正在增殖中的軟骨成骨細胞TGF-β1呈陽性染色，鈣化并轉變?yōu)樾鹿堑能浌羌捌浔砻娴某晒羌毎?，其中?4d時對照組TGF-β1呈強陽性染色，與實驗組比較有表達差異(P

7、<0.05)。(3)新鮮骨痂中TGF-β1的蛋白表達：Western-blot分析顯示對照組的骨痂中TGF-β1蛋白隨著時間增加表達量逐漸上漲，在術后第14d表達量最高，之后趨于平穩(wěn)，在14d時間點，失神經(jīng)實驗組條帶蛋白表達低于單純性骨折組(p<0.05)。
　　 結論(1)細胞實驗表明，外源性地加入CGRP影響成骨細胞中TGF-β1的表達，CGRP的濃度與TGF-β1的表達呈正相關性，CGRP可能存在上調細胞TGF-β1合成的