RNA干擾雙靶向沉默mdr1和GCS基因逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥.pdf

1、研究目的: 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。除手術(shù)治療外，化療和內(nèi)分泌治療是乳腺癌治療的重要手段。對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥是導(dǎo)致乳腺癌化療失敗的重要因素。所謂多藥耐藥是指腫瘤對(duì)一種藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生抗藥性。 乳腺癌多藥耐藥的機(jī)制較復(fù)雜，而過表達(dá)ATP膜轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白是重要的因素之一。由多藥耐藥基因1（mdr1）編碼的P-糖蛋白就是該家族的一員。與其它膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相同，P-糖蛋白通過水解A

2、TP產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，從而降低藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。目前報(bào)道顯示許多抗腫瘤藥物包括長春新堿、多柔米星、紫杉醇等均為P-糖蛋白的作用底物。50％的乳腺癌耐藥與P-糖蛋白的表達(dá)相關(guān)。因此逆轉(zhuǎn)由P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥將對(duì)乳腺癌的治療起重要作用。 為了逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥，人們采用了許多方法，包括化學(xué)藥物治療、天然藥物治療、免疫學(xué)治療、基因治療等?；瘜W(xué)合成的抑制劑可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療

3、藥物的敏感性。但是化學(xué)藥物在達(dá)到治療濃度時(shí)往往具有較大的毒性。選擇性阻斷耐藥蛋白mRNA的表達(dá)是一種有效的逆轉(zhuǎn)耐藥的方法，本課題組曾經(jīng)分別應(yīng)用反義寡核苷酸以及核酶等方法逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的MDR的研究，各種方法均能在不同程度上抑制P-gp的作用，但未能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果；這可能與核酶的抑制效率較低以及反義寡核苷酸和核酶的降解效率受靶基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較大，不容易篩選靶序列有關(guān)，此外耐藥腫瘤細(xì)胞中存在其他的機(jī)制也可能是逆轉(zhuǎn)效果不理想的原

4、因。 近期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（GCS）也是引起腫瘤多藥耐藥的因素之一。GCS催化UDP-glucose上的糖基與神經(jīng)酰胺相結(jié)合，使細(xì)胞逃避神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的促凋亡作用。神經(jīng)酰胺，是由細(xì)胞膜神經(jīng)鞘磷脂水解產(chǎn)生的一種脂質(zhì)分子，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的第二信使，參與了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，GCS糖基化產(chǎn)物葡萄糖神經(jīng)酰胺（Glucosylceramide，GlcCer）在耐藥腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，抑制神經(jīng)酰胺的糖

5、基化可以逆轉(zhuǎn)對(duì)化療藥物的耐藥性。許多化療藥物可以抑制GCS的活性并增加細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的合成。如PPPP（1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3一pyrrolidino-l-proranol）、PDMP（1-phenyl-2-dsdecanoylamino-3-morpholino-1-propanol）和cyclosorin A。但在臨床實(shí)驗(yàn)中這些藥物特異性不高，且具有較強(qiáng)副作用，限制了其應(yīng)用。 RNA干

6、擾技術(shù)是新近研究中有效的分析基因功能的工具。其高效的基因沉默功能使其一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力。該技術(shù)通過導(dǎo)入細(xì)胞雙鏈RNA（dsRNA）而導(dǎo)致序列特異性的基因沉默。dsRNA在體內(nèi)可以被一種具有RNaseⅢ樣活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶（Dicer）作用切割成21-23bp長的小干擾RNA（siRNA）。siRNA接著與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，特異性識(shí)別

7、和切割目的mRNA。由于RNAi具有特異性和高效性，并且和反義寡核苷酸相比，siRNA介導(dǎo)的基因沉默更有效，持續(xù)時(shí)間更長，因此，我們擬應(yīng)用攜帶RNA干擾序列的重組質(zhì)粒載體同時(shí)沉默乳腺癌中mdr1基因和GCS基因的表達(dá)，從而提高乳腺癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效率。 研究方法: 1．分別設(shè)計(jì)并合成針對(duì)mdr1基因和GCS基因的雙鏈干擾RNA序列，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER中，經(jīng)酶切及測序鑒定。然后選用合適的酶切位點(diǎn)酶切，獲得含

8、有RNA干擾序列及其上游的H1啟動(dòng)子的片段，并將其插入到含有綠色熒光蛋白（EGFP）和穩(wěn)定篩選標(biāo)記的質(zhì)粒載體pEGFP-C1中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS。酶切及測序鑒定正確后，大量擴(kuò)增。 2．應(yīng)用脂質(zhì)體將上述干擾質(zhì)粒載體同時(shí)轉(zhuǎn)染到高表達(dá)P-糖蛋白和GCS的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADM中，并設(shè)空白對(duì)照組及僅轉(zhuǎn)染一種干擾質(zhì)粒組。培養(yǎng)48h后，通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞中mdr1 mRNA和GCS

9、mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用western blot檢測P-糖蛋白和GCS蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用羅丹明外排實(shí)驗(yàn)檢測P-糖蛋白外排功能，應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞對(duì)阿霉素、長春新堿的半數(shù)細(xì)胞抑制濃度（IC50）的改變。 3．各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同載體后，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加用G418對(duì)其進(jìn)行篩選。約2周后得到穩(wěn)定表達(dá)干擾RNA序列的細(xì)胞系。繼續(xù)培養(yǎng)3周后，通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用wester

10、n blot檢測P-糖蛋白和GCS蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用羅丹明外排實(shí)驗(yàn)檢測P-糖蛋白外排功能，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞耐藥指數(shù)的改變。從而對(duì)RNA干擾的長期逆轉(zhuǎn)效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1．轉(zhuǎn)染48h后，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞中mdr1 mRNA和G-CS mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與MCF-7/ADM相比（我們假定MCF-7/ADM組的相對(duì)mRNA水平為100％），M0組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-MDR1）、G0

11、組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-GCS）、GM0組（共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS）的mdr1 mRNA的表達(dá)水平分別降為1．105±0．99％、38．75±9．7％和0．4491±0．22％，而GCS mRNA的表達(dá)水平分別降為7．464±3．0％、38．34±16％and3．142±0．64％，顯著低于MCF-7/ADM組及對(duì)照組（P<0．01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GM0細(xì)胞的MDR1 mRNA和GCS mRNA表達(dá)水平也

12、低于單獨(dú)干擾組。Western blot檢測結(jié)果表明GM0組細(xì)胞兩種蛋白水平明顯減低，且顯著低于M0和G0組。羅丹明外排實(shí)驗(yàn)顯示：耐藥細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為2．727％±0．4834，G0、M0細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為33．71％±2．267和17．25％±1．024，而GM0組細(xì)胞熒光強(qiáng)度為50．12±6．349。RNA干擾組細(xì)胞與MCF-7/ADM組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。而GM0組與G0、M0組相比，P-gp功能顯著降低。M

13、TT法檢測細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性，發(fā)現(xiàn)G0、M0、GM0組細(xì)胞對(duì)阿霉素和長春新堿耐藥性明顯降低，GM0組明顯低于G0和M0組。此外分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，抑制mdr1基因的表達(dá)會(huì)引起GCS基因表達(dá)的降低，而下調(diào)GCS基因也會(huì)導(dǎo)致mdr1基因表達(dá)下調(diào)。 2．篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系后，培養(yǎng)3周，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：M1組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-MDR1）、G1組（轉(zhuǎn)染質(zhì)

14、粒pEGFP-GCS）、GM1組（共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS）mdr1 mRNA的表達(dá)水平分別降為MCF-7/ADM組的46．04±3．8％、13．39±0．69％和0．6715±0．71％，而GCS mRNA的表達(dá)水平分別降為64．11±2．7％、25．28±5．9％and4．321±2．7％，顯著低于MCF-7/ADM組（P<0．01）。且GM1細(xì)胞的MDR1和GCS mRNA表達(dá)水平也低于單獨(dú)干擾組。而與瞬

15、時(shí)轉(zhuǎn)染組相比，mRNA水平無明顯差異。Western blot檢測結(jié)果表明GM1細(xì)胞兩種蛋白水平明顯減低，且顯著低于M1和G1組。羅丹明外排實(shí)驗(yàn)顯示：G1、M1、GM1細(xì)胞熒光強(qiáng)度均較MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而GM1組熒光強(qiáng)度明顯高于G1和M1組。三組細(xì)胞與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組相比無明顯差異。MTT法檢測細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性，發(fā)現(xiàn)G1、M1、GM1組細(xì)胞對(duì)阿霉素和長春新堿耐藥性明顯降低，與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組相比差異不大。 結(jié)論

16、: 1．RNA干擾可以通過抑制靶基因mRNA的表達(dá)，從而顯著降低蛋白的產(chǎn)生。 2．瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果表明抑制mdr1基因或GCS基因可以有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥，而同時(shí)抑制mdr1基因和GCS基因比單獨(dú)抑制更有效。 3．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后檢測結(jié)果顯示攜帶RNA干擾片度的質(zhì)?？梢暂^長時(shí)間抑制靶基因的表達(dá)（至少3周）。 4．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mdr1基因表達(dá)下調(diào)可以引起GCS基因的表達(dá)部分抑制，反之亦然，說明乳腺癌中mdr1基因