MDR1啟動子調(diào)控的CD∷upp基因及MDR1干擾RNA逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：(1)構(gòu)建由人MDR1啟動子調(diào)控的胞嘧啶脫氨酶-尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶融合基因(CD∷upp)表達(dá)的重組腺病毒；(2)探討MDR1啟動子調(diào)控CD∷upp轉(zhuǎn)移及其與5-氟胞嘧啶(5-FC)聯(lián)合應(yīng)用對紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞株的特異性殺傷作用及對卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用及荷瘤裸鼠的生存時間。 方法：(1)從PORF-CD∷upp質(zhì)粒中切下CD∷upp基因，插入PMDR1-280質(zhì)粒的MDR1啟動子下游，再從中切下目的基因M

2、DR1-CD∷upp，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，獲得帶目的基因的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-MDR1-CD∷upp。經(jīng)內(nèi)切酶、PCR及測序鑒定后將其與含有pAdeasy-1的BJ5183菌電轉(zhuǎn)化，獲得的陽性克隆經(jīng)線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)及PCR擴(kuò)增出重組腺病毒中的MDR1、CD∷upp目的基因加以鑒定。(2)將MDR1啟動子調(diào)控的CD∷upp基因轉(zhuǎn)染2對人卵巢癌紫杉醇耐藥及非耐藥株A2780TS和A

3、2780；SKOV3TS和SKOV3，加入含5-FC的培養(yǎng)液培養(yǎng)，MTT法檢測細(xì)胞存活率；轉(zhuǎn)基因A2780TS、SKOV3TS耐藥細(xì)胞分別與未轉(zhuǎn)基因A2780TS、SKOV3TS以不同比例混合，觀察旁觀者效應(yīng)。(3)將整合有MDR1-CD∷upp基因的腺病毒0.1ml(1×109pfu/ml)注入卵巢癌裸鼠皮下移植瘤瘤體內(nèi)，聯(lián)合5-FC裸鼠腹腔內(nèi)注射，，觀察各組裸鼠存活情況。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了含MDR1-CD∷upp靶向自

4、殺基因的重組腺病毒載體AdMDR1-CD∷upp，病毒滴度為3.0×1010pfu/ml。(2)MDR1-CD∷upp基因在以上2對細(xì)胞株中可穩(wěn)定表達(dá)，聯(lián)合使用5-FC后對A2780TS、SKOV3TS耐藥細(xì)胞特異性殺傷作用明顯高于A2780、SKOV3非耐藥細(xì)胞株。同時，轉(zhuǎn)MDR1-CD∷upp基因的A2780TS、SKOV3TS耐藥細(xì)胞聯(lián)合5-FC后可通過旁觀者效應(yīng)殺傷周圍未轉(zhuǎn)染CD∷upp基因的耐藥細(xì)胞。(3)該重組腺病毒對卵巢癌