HIV-1疫苗免疫策略與中國(guó)既往獻(xiàn)血人群HIV-1感染者T細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、本文主要目的是探索粘膜免疫策略與不同HIV免疫原順序免疫策略誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特征，以尋求更有效的疫苗免疫策略；研究同時(shí)探索了既往獻(xiàn)血人群HIV感染者人群分泌IFN-γ的HIV-1特異性T細(xì)胞反應(yīng)的特征及與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量之間的關(guān)系，以期為疫苗的研制提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 對(duì)粘膜免疫系統(tǒng)的有效刺激需要兩個(gè)條件，一是疫苗抗原能夠有效的投遞到粘膜淋巴組織；二是需要合適的粘膜載體或佐劑。 首先，探索了聚乙烯亞胺(p

2、olyethylenimine，PEI)作為粘膜佐劑與疫苗載體的作用。 第一步，以表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的pEGFP質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞為模型，優(yōu)化PEI作為DNA疫苗載體的條件。利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定PEI/DNA復(fù)合體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的效率，轉(zhuǎn)染效率表達(dá)為EGFP陽(yáng)性細(xì)胞在所有細(xì)胞中的百分?jǐn)?shù)；本研究探討了不同N/P比值、不同復(fù)合體形成媒介、復(fù)合體不同保存時(shí)間及溫度等因素對(duì)PEI/DNA轉(zhuǎn)染效率的影響。研究結(jié)果表明，PEI/

3、DNA的N/P比值為10∶1時(shí)，PEI轉(zhuǎn)染的效率較高，與Lipofectamine的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)；150mmol/L NaCl和5％葡萄糖溶液作為復(fù)合體形成媒介，其轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于其他所用媒介：PEI/DNA復(fù)合體在室溫中保存15min時(shí)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于其他保存時(shí)間和溫度。體外實(shí)驗(yàn)表明，PEI是一種相對(duì)安全、高效的非病毒基因載體。 第二步，在體外條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用PEI/DNA鼻腔粘膜初免和重組天壇痘苗肌肉注射給予系統(tǒng)加強(qiáng)的免疫策略

4、、以HIV-1 Gag為免疫原，在BALB/c小鼠體內(nèi)測(cè)試PEI作為粘膜佐劑與疫苗載體的效果。在第0、2、4周，以10μg DNA疫苗和相應(yīng)的PEI復(fù)合體滴鼻免疫BALB/c小鼠，在第6周，以10<'7>PFU的重組天壇痘苗肌肉注射加強(qiáng)免疫。研究結(jié)果表明，PEI作為粘膜免疫載體用于BALB/c小鼠初免時(shí)，ELISPOT與ICS結(jié)果分別為207±44 SFCs/10<'6>個(gè)脾細(xì)胞與1.19±0.17％特異性CD3<'+>CD8<'+>T

5、細(xì)胞，與裸DNA作為初免相比(ELISPOT與ICS結(jié)果分別為92±2 SFCs/10<'6>個(gè)脾細(xì)胞，p=0.0404和0.60±0.06％IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞，p=0.0358)，顯示PEI可以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。采用ELISA檢測(cè)HIV特異性抗體，血清特異性IgG抗體在使用和不使用PEI的免疫組均為陽(yáng)性，兩組間強(qiáng)度無(wú)差別。PEI/DNA 3X/rTTV免疫組誘導(dǎo)的肺灌洗液特異性IgA抗體水平顯著高于DNA 3X

6、/rTTV免疫組(OD:1.39±0.22 VS 0.73±0.05，p=0.0445)，生殖道灌洗液特異性IgA抗體水平差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OD：2.01±0.16 VS 1.08±0.28，p=0.0469)。研究結(jié)果表明：PEI可以顯著提高DNA疫苗的免疫原性，而且粘膜初免可以同時(shí)誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫力，系統(tǒng)加強(qiáng)可以同時(shí)提高粘膜免疫途徑的體液免疫效果。 盡管PEI可以顯著提高DNA疫苗的免疫原性，但是所獲得的免疫原性與傳統(tǒng)

7、的肌肉途徑進(jìn)行DNA初免和病毒載體加強(qiáng)相比依然較弱，因而，探索能夠進(jìn)一步提高粘膜免疫原性的策略；與此同時(shí)，為提高疫苗接種的可行性與降低成本，同時(shí)測(cè)試減少疫苗免疫次數(shù)的可能性。在BALB/c小鼠采用重組痘苗滴鼻或DNA疫苗肌注初免，再用重組痘苗或DNA疫苗肌注加強(qiáng)的免疫策略來(lái)觀察免疫效果。與重組痘苗滴鼻途徑初免/重組痘苗滴鼻途徑加強(qiáng)、DNA疫苗肌肉注射途徑初免/重組痘苗滴鼻途徑加強(qiáng)、DNA疫苗肌肉注射途徑初免/重組痘苗肌肉注射加強(qiáng)等免疫策

8、略相比，重組痘苗滴鼻與DNA疫苗肌注各一次，可誘導(dǎo)671±122 SFCs/10<'6>個(gè)脾細(xì)胞，顯著高于肌肉的常規(guī)DNA初免與加強(qiáng)策略(391±198 SFCs/10<'6>個(gè)脾細(xì)胞)，更高于其他的策略與組合。與此同時(shí)，這一新策略誘導(dǎo)了最高水平的生殖道和第二高水平肺內(nèi)的IgA抗體應(yīng)答；誘導(dǎo)的IgG2a和IgG1水平相當(dāng)(IgG2a.IgGl=1.2)，因此免疫反應(yīng)兼具Th1型和Th2型；可以誘導(dǎo)高親和力T細(xì)胞的表達(dá)；研究還發(fā)現(xiàn)重組痘苗

9、滴鼻初免/DNA疫苗肌注加強(qiáng)組主要使用Vβ8.3受體(25.5％)，次要使用的受體是Vβ8.1/8.2(11.4％)，Vβ6(9.3％)，Vβ14(7.5％)和Vβ3(7.1％)。研究結(jié)果表明，重組痘苗滴鼻初免/DNA疫苗肌注加強(qiáng)的免疫策略免疫可以誘導(dǎo)相對(duì)最高水平細(xì)胞免疫和體液免疫，從安全性考慮，對(duì)載體進(jìn)行進(jìn)一步減毒是必需的。針對(duì)我國(guó)多種HIV-1亞型平行流行的特點(diǎn)，以活化針對(duì)病毒保守區(qū)為主、同時(shí)抗多種亞型的策略顯得尤為重要。探索了以活

10、化針對(duì)病毒保守區(qū)免疫反應(yīng)為目標(biāo)的、利用不同HIV免疫原進(jìn)行順序免疫策略，并與傳統(tǒng)免疫策略之間誘導(dǎo)免疫反應(yīng)進(jìn)行了比較。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為以下5組：空載體對(duì)照組，來(lái)源于B′亞型免疫原的單獨(dú)免疫組，來(lái)源于A/E、B′和B′C亞型免疫原順序免疫的順序免疫組1，來(lái)源于A/E、B′C和B′亞型免疫原順序免疫的順序免疫組2和各個(gè)亞型免疫原混合免疫的混合免疫組。在第0、2周肌注相應(yīng)的DNA疫苗，第5周肌注相應(yīng)的重組痘苗病毒疫苗，通過(guò)ELISPO

11、T方法檢測(cè)能夠誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的多肽表位，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性多肽進(jìn)行親和力的檢測(cè)，從而推斷不同免疫方式誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)譜和強(qiáng)度。研究結(jié)果表明，用不同HIV-1亞型來(lái)源的免疫原進(jìn)行順序交叉免疫能夠逐漸提高機(jī)體針對(duì)各個(gè)亞型HIV-1抗原中共享的保守表位的免疫原性，進(jìn)一步對(duì)表位在各亞型HIV-1抗原保守程度的分析發(fā)現(xiàn)，這一免疫策略誘導(dǎo)的主要是針對(duì)最保守表位的免疫反應(yīng)，對(duì)非保守表位的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力則較弱。由于HIV自然感染時(shí)，針對(duì)一

12、些高保守表位的T細(xì)胞免疫反應(yīng)并不強(qiáng)，而該策略在提供針對(duì)各毒株的交叉免疫反應(yīng)的潛能很大，提示順序交叉免疫策略不失為一種誘導(dǎo)高保守表位T細(xì)胞免疫反應(yīng)的新策略。 設(shè)計(jì)更佳的疫苗免疫策略需要人群樣本的數(shù)據(jù)作為支持，使用覆蓋HIV-1 B亞型病毒全基因組序列的肽庫(kù)檢測(cè)中國(guó)安徽阜陽(yáng)市1992-1995年期間既往獻(xiàn)血HIV感染者人群，分析分泌IFN-γ的HIV-1特異性T細(xì)胞反應(yīng)的特征及其與患者外周血CD4<'+>T細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量之間的關(guān)

13、系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)月和12個(gè)月兩次隨訪時(shí)，該人群CD4<'+>T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與病毒載量之間均存在明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.2725，r=-0.3351)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0015，p<0.0001)。ELISPOT研究結(jié)果表明，全基因HIV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)與病毒載量之間無(wú)相關(guān)性(6個(gè)月隨訪：r=-0.0535，p=0.5407；12個(gè)月隨訪：r=0.1366，p=0.1128)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分肽池的HIV特異性T淋巴細(xì)