去細胞化的肝臟支架在細胞移植中的應用研究.pdf

1、成功的器官移植是治療終末期器官功能衰竭的終極手段,但對供體的需求遠遠大于現(xiàn)有的供體數(shù)量,特別是在亞洲國家,由于捐獻制度和理念的不同,中國、日本及其他國家的器官移植因為供體數(shù)量而受到限制。許多患者在等待器官的過程中失去生命。因此急需發(fā)現(xiàn)新的組織工程學方法或者再生醫(yī)學策略來支持發(fā)展生物人工肝、細胞移植以至于器官移植來臨時替代器官的功能。而將細胞移植與生物工程結合起來可能能解決這一難題。本研究將著重探討生物工程技術在肝臟前體細胞移植和胰島細胞

2、移植中的應用研究。
　　肝細胞移植是治療肝臟各種疾病的非常具有吸引力的治療手段。但距離臨床應用治療肝臟疾病還有一定的距離。肝細胞移植的臨床應用因為難以獲取好的供體以分離細胞而受到限制。近來的文章聚焦于可以分化為肝臟細胞的干細胞,以及肝臟的重新再細胞化策略來降低移植的細胞數(shù)量。暫時采取目前的免疫耐受方案可以克服宿主對異體移植細胞的免疫反應。近來已有研究發(fā)現(xiàn)對產(chǎn)后細胞的重新編程可以誘導多能干細胞,潛在的為病人提供了針對于患者的自體移植

3、細胞來源。發(fā)現(xiàn)合適的干細胞來源可減少可移植細胞的數(shù)量。基于成年干細胞治療嚴重慢性肝臟疾病的研究已經(jīng)接近于臨床,但是在胚胎肝臟前體細胞、胚胎干細胞以及誘導分化的多功能干細胞應用于人類前,關于安全性、有效性以及移植的位點還需要進一步研究。
　　胰島細胞與肝臟細胞在胚胎時期具有同樣的起源。胰島細胞移植也是目前僅有的能根據(jù)血糖變化反饋調(diào)節(jié)正常的胰島素分泌,以達到長期穩(wěn)定控制血糖目的的治療手段。胰島移植由于其創(chuàng)傷小,可重復替代破壞的內(nèi)源性胰

4、島。胰島能通過多種方式進行預處理降低免疫排斥反應和增強移植物功能。此外,胰島移植不會像胰腺整體移植那樣存在血栓形成和移植胰胰腺炎等潛在的并發(fā)癥。自從Edmonton方案實施后,胰島移植取得了巨大的進步,但由于免疫排斥的存在,5年胰島素不依賴率仍較低。另外由于胰島移植的方式是通過門靜脈系統(tǒng)將胰島注入肝臟門靜脈系統(tǒng),有潛在的門靜脈栓塞、影響受體肝功能等并發(fā)癥的危險。因此,也需要尋找一個新的移植位點一方面與目前成熟的已經(jīng)應用于臨床的肝臟注入方

5、式結合,另一方面減少和降低并發(fā)癥。
　　細胞移植可以作為器官移植的備用選項,但大多數(shù)細胞的生長和增殖都需要特定的微環(huán)境和三維結構,組織工程學方法可以接近并達到這一條件。組織工程學方法的最終目標是重建組織或者器官,以此在生理上和功能上替代衰竭或受損的相應器官,發(fā)揮正常人體的器官功能。成功的組織器官工程學包括至少3個基本元素:一是組織特異性細胞,二是器官支架材料,三是要有適合組織形成的生長環(huán)境。目前在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已

6、經(jīng)取得非常成功的進步。但是,對大器官如心臟、肺、腎臟以及肝臟等整個器官重建要求在移植后血液能迅速支持,這就需要重建或保持廣泛的血管網(wǎng)絡來運送營養(yǎng)物質(zhì)和進行氣體交換,使移植后的組織工程化的器官能得到營養(yǎng)供應和氧分支持。
　　多種細胞在體外培養(yǎng)中通過去分化或者上皮-間質(zhì)轉化在幾天內(nèi)失去它們的形態(tài)和功能。這樣側面證明了微環(huán)境對維持細胞功能起著非常重要的作用。細胞外基質(zhì)不僅僅給組織細胞提供支架,也調(diào)節(jié)它們的粘附、遷移以及分化、增殖和細胞存

7、活,并且影響不同細胞間的作用。肝臟去細胞化的研究使從整體器官通過表面活性劑灌注器官而獲得組織特異性的細胞外基質(zhì)成為可能。與傳統(tǒng)的去細胞方法將薄層的細胞組織浸入到不同的液體中獲得去細胞的組織不同,整體肝臟器官去細胞支架維持了整體的血管網(wǎng)絡床。這些血管網(wǎng)絡系統(tǒng)不僅為目標類型的細胞通過傳統(tǒng)路徑再植提供可能,也為再植的細胞提供了三維的生長環(huán)境,而薄層的去細胞化組織只能提供二維的生長空間。于是,我們假設去細胞的肝臟支架(decellularize

8、dlivermatrix,DLM)可能為細胞移植提供一個較為理想的微環(huán)境和支架結構。
　　因此,本課題基于以上理論依據(jù),進行了如下研究:
　　第一部分，去細胞化肝臟支架的獲取
　　目的:通過對多種方法的嘗試,使用灌注法對小鼠的肝臟進行灌注去細胞化,檢測去細胞化的肝臟的形態(tài)、結構,分析去細胞化肝臟的DNA含量,為進一步講去細胞化肝臟用于細胞培養(yǎng)及移植中提供重要的理論基礎和重要信息。
　　方法:取成年BALB/c小鼠

9、,在麻醉的狀態(tài)下使用并優(yōu)化門靜脈灌注法的去細胞化程序,獲取小鼠去細胞化的肝臟支架,對獲取的肝臟支架進行HE染色和免疫組化染色,并將去細胞化的肝臟支架移植于裸鼠中,檢測其血管生成情況。
　　結果:1、使用優(yōu)化的灌注法可以在較短時間內(nèi)獲得滿意的去細胞化結果;2、去細胞化的肝臟支架DNA含量極低,達到去細胞化的效果;3、去細胞化的肝臟染色未見明顯細胞組分和細胞核成分;4、去細胞化的肝臟保留了原有的血管支架和膠原成分;5、在小鼠中去細胞化

10、的肝臟移植到腎臟包膜下能觀察到血管生成。
　　結論:通過優(yōu)化的門靜脈灌注法可以獲得滿意的肝臟支架,去細胞化肝臟可以作為良好的載體應用于體內(nèi)及體外實驗,為細胞培養(yǎng)提供三維結構,在體中可以加速血管生成,為待移植的細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧分支持。
　　第二部分，去細胞化肝臟支架在肝前體細胞移植中的應用研究
　　目的:獲取肝臟前體細胞并鑒定,探討去細胞化的肝臟支架是否能為肝臟前體細胞在體及體外生長、增殖提供組織相容性的三維生長環(huán)境

11、。
　　方法:分離小鼠胚胎14.5天的肝臟,獲取肝臟前體細胞,使用逆轉錄病毒感染肝臟前體細胞使其可逆性永生化后將永生化的肝臟前體細胞灌注于去細胞化的肝臟支架中,觀察其在體外培養(yǎng)2周和體內(nèi)腎臟包膜下2周的生長增殖情況,并對相關影響因素進行探討。并探討其機制。
　　結果:我們成功分離和構建了可逆的永生化的肝前體細胞株,該永生化的肝細胞株能在特定條件下向肝細胞分化,該細胞株在去細胞化的肝臟支架中能生長增殖,并誘導血管新生。同時該永

12、生化的細胞株在體內(nèi)及體外均未觀察到潛在風險。在移植后2周,可觀察到標記的種植于去細胞化的肝臟支架中的肝臟前體細胞在腎臟包膜下迅速增殖;免疫組化染色提示這些細胞具有肝細胞的部分功能,并觀察到血管新生。EGF可以加強再植的永生化的肝臟前體細胞的增殖和分化。
　　結論:使用逆轉錄病毒感染可以使肝臟前體細胞得到可逆性的安全的永生化狀態(tài),為肝臟細胞的大量獲取提供了來源,去細胞化的肝臟支架可以為肝臟前體細胞提供賴以生長的三維環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)、氧

13、分支持,EGF能促進肝臟前體細胞在肝臟支架中的分化和增殖,肝臟前體細胞作為細胞成分而肝臟支架作為理想的支撐材料能應用于肝臟細胞移植。
　　第三部分，去細胞化肝臟支架在胰島移植中的應用研究
　　目的:獲取胰島細胞并測定其功能,探討胰島細胞在去細胞化的肝臟支架中的在體生長情況。
　　方法:使用膠原蛋白酶消化法以及非連續(xù)性梯度分離法獲得成年小鼠的胰腺,純化胰島細胞,在體外檢測胰島細胞的功能后,將胰島細胞灌注于去細胞化的肝臟支

14、架中,觀察其在腎臟包膜下的生長增殖情況。
　　結果:使用膠原蛋白酶消化法可以獲得大量的胰島,大約為150-200個胰島/小鼠。使用非連續(xù)性梯度分離法可以獲得純化的胰島,這些胰島在體外具有分泌胰島素的功能。將胰島細胞、種植于去細胞化肝臟中的胰島細胞移植于糖尿病小鼠中,發(fā)現(xiàn)胰島在去細胞化肝臟支架中能存活并發(fā)揮同普通胰島腎臟包膜下移植同樣的功能。
　　結論:使用膠原蛋白酶消化法可以有效獲得小鼠胰島細胞,去細胞化的肝臟支架可以為胰島