去細(xì)胞化的肝臟支架在細(xì)胞移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、成功的器官移植是治療終末期器官功能衰竭的終極手段,但對供體的需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于現(xiàn)有的供體數(shù)量,特別是在亞洲國家,由于捐獻(xiàn)制度和理念的不同,中國、日本及其他國家的器官移植因?yàn)楣w數(shù)量而受到限制。許多患者在等待器官的過程中失去生命。因此急需發(fā)現(xiàn)新的組織工程學(xué)方法或者再生醫(yī)學(xué)策略來支持發(fā)展生物人工肝、細(xì)胞移植以至于器官移植來臨時(shí)替代器官的功能。而將細(xì)胞移植與生物工程結(jié)合起來可能能解決這一難題。本研究將著重探討生物工程技術(shù)在肝臟前體細(xì)胞移植和胰島細(xì)胞

2、移植中的應(yīng)用研究。
　　肝細(xì)胞移植是治療肝臟各種疾病的非常具有吸引力的治療手段。但距離臨床應(yīng)用治療肝臟疾病還有一定的距離。肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用因?yàn)殡y以獲取好的供體以分離細(xì)胞而受到限制。近來的文章聚焦于可以分化為肝臟細(xì)胞的干細(xì)胞,以及肝臟的重新再細(xì)胞化策略來降低移植的細(xì)胞數(shù)量。暫時(shí)采取目前的免疫耐受方案可以克服宿主對異體移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)。近來已有研究發(fā)現(xiàn)對產(chǎn)后細(xì)胞的重新編程可以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,潛在的為病人提供了針對于患者的自體移植

3、細(xì)胞來源。發(fā)現(xiàn)合適的干細(xì)胞來源可減少可移植細(xì)胞的數(shù)量?；诔赡旮杉?xì)胞治療嚴(yán)重慢性肝臟疾病的研究已經(jīng)接近于臨床,但是在胚胎肝臟前體細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)分化的多功能干細(xì)胞應(yīng)用于人類前,關(guān)于安全性、有效性以及移植的位點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究。
　　胰島細(xì)胞與肝臟細(xì)胞在胚胎時(shí)期具有同樣的起源。胰島細(xì)胞移植也是目前僅有的能根據(jù)血糖變化反饋調(diào)節(jié)正常的胰島素分泌,以達(dá)到長期穩(wěn)定控制血糖目的的治療手段。胰島移植由于其創(chuàng)傷小,可重復(fù)替代破壞的內(nèi)源性胰

4、島。胰島能通過多種方式進(jìn)行預(yù)處理降低免疫排斥反應(yīng)和增強(qiáng)移植物功能。此外,胰島移植不會像胰腺整體移植那樣存在血栓形成和移植胰胰腺炎等潛在的并發(fā)癥。自從Edmonton方案實(shí)施后,胰島移植取得了巨大的進(jìn)步,但由于免疫排斥的存在,5年胰島素不依賴率仍較低。另外由于胰島移植的方式是通過門靜脈系統(tǒng)將胰島注入肝臟門靜脈系統(tǒng),有潛在的門靜脈栓塞、影響受體肝功能等并發(fā)癥的危險(xiǎn)。因此,也需要尋找一個(gè)新的移植位點(diǎn)一方面與目前成熟的已經(jīng)應(yīng)用于臨床的肝臟注入方

5、式結(jié)合,另一方面減少和降低并發(fā)癥。
　　細(xì)胞移植可以作為器官移植的備用選項(xiàng),但大多數(shù)細(xì)胞的生長和增殖都需要特定的微環(huán)境和三維結(jié)構(gòu),組織工程學(xué)方法可以接近并達(dá)到這一條件。組織工程學(xué)方法的最終目標(biāo)是重建組織或者器官,以此在生理上和功能上替代衰竭或受損的相應(yīng)器官,發(fā)揮正常人體的器官功能。成功的組織器官工程學(xué)包括至少3個(gè)基本元素:一是組織特異性細(xì)胞,二是器官支架材料,三是要有適合組織形成的生長環(huán)境。目前在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已

6、經(jīng)取得非常成功的進(jìn)步。但是,對大器官如心臟、肺、腎臟以及肝臟等整個(gè)器官重建要求在移植后血液能迅速支持,這就需要重建或保持廣泛的血管網(wǎng)絡(luò)來運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)和進(jìn)行氣體交換,使移植后的組織工程化的器官能得到營養(yǎng)供應(yīng)和氧分支持。
　　多種細(xì)胞在體外培養(yǎng)中通過去分化或者上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在幾天內(nèi)失去它們的形態(tài)和功能。這樣側(cè)面證明了微環(huán)境對維持細(xì)胞功能起著非常重要的作用。細(xì)胞外基質(zhì)不僅僅給組織細(xì)胞提供支架,也調(diào)節(jié)它們的粘附、遷移以及分化、增殖和細(xì)胞存

7、活,并且影響不同細(xì)胞間的作用。肝臟去細(xì)胞化的研究使從整體器官通過表面活性劑灌注器官而獲得組織特異性的細(xì)胞外基質(zhì)成為可能。與傳統(tǒng)的去細(xì)胞方法將薄層的細(xì)胞組織浸入到不同的液體中獲得去細(xì)胞的組織不同,整體肝臟器官去細(xì)胞支架維持了整體的血管網(wǎng)絡(luò)床。這些血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)不僅為目標(biāo)類型的細(xì)胞通過傳統(tǒng)路徑再植提供可能,也為再植的細(xì)胞提供了三維的生長環(huán)境,而薄層的去細(xì)胞化組織只能提供二維的生長空間。于是,我們假設(shè)去細(xì)胞的肝臟支架(decellularize

8、dlivermatrix,DLM)可能為細(xì)胞移植提供一個(gè)較為理想的微環(huán)境和支架結(jié)構(gòu)。
　　因此,本課題基于以上理論依據(jù),進(jìn)行了如下研究:
　　第一部分，去細(xì)胞化肝臟支架的獲取
　　目的:通過對多種方法的嘗試,使用灌注法對小鼠的肝臟進(jìn)行灌注去細(xì)胞化,檢測去細(xì)胞化的肝臟的形態(tài)、結(jié)構(gòu),分析去細(xì)胞化肝臟的DNA含量,為進(jìn)一步講去細(xì)胞化肝臟用于細(xì)胞培養(yǎng)及移植中提供重要的理論基礎(chǔ)和重要信息。
　　方法:取成年BALB/c小鼠

9、,在麻醉的狀態(tài)下使用并優(yōu)化門靜脈灌注法的去細(xì)胞化程序,獲取小鼠去細(xì)胞化的肝臟支架,對獲取的肝臟支架進(jìn)行HE染色和免疫組化染色,并將去細(xì)胞化的肝臟支架移植于裸鼠中,檢測其血管生成情況。
　　結(jié)果:1、使用優(yōu)化的灌注法可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得滿意的去細(xì)胞化結(jié)果;2、去細(xì)胞化的肝臟支架DNA含量極低,達(dá)到去細(xì)胞化的效果;3、去細(xì)胞化的肝臟染色未見明顯細(xì)胞組分和細(xì)胞核成分;4、去細(xì)胞化的肝臟保留了原有的血管支架和膠原成分;5、在小鼠中去細(xì)胞化

10、的肝臟移植到腎臟包膜下能觀察到血管生成。
　　結(jié)論:通過優(yōu)化的門靜脈灌注法可以獲得滿意的肝臟支架,去細(xì)胞化肝臟可以作為良好的載體應(yīng)用于體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),為細(xì)胞培養(yǎng)提供三維結(jié)構(gòu),在體中可以加速血管生成,為待移植的細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧分支持。
　　第二部分，去細(xì)胞化肝臟支架在肝前體細(xì)胞移植中的應(yīng)用研究
　　目的:獲取肝臟前體細(xì)胞并鑒定,探討去細(xì)胞化的肝臟支架是否能為肝臟前體細(xì)胞在體及體外生長、增殖提供組織相容性的三維生長環(huán)境

11、。
　　方法:分離小鼠胚胎14.5天的肝臟,獲取肝臟前體細(xì)胞,使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染肝臟前體細(xì)胞使其可逆性永生化后將永生化的肝臟前體細(xì)胞灌注于去細(xì)胞化的肝臟支架中,觀察其在體外培養(yǎng)2周和體內(nèi)腎臟包膜下2周的生長增殖情況,并對相關(guān)影響因素進(jìn)行探討。并探討其機(jī)制。
　　結(jié)果:我們成功分離和構(gòu)建了可逆的永生化的肝前體細(xì)胞株,該永生化的肝細(xì)胞株能在特定條件下向肝細(xì)胞分化,該細(xì)胞株在去細(xì)胞化的肝臟支架中能生長增殖,并誘導(dǎo)血管新生。同時(shí)該永

12、生化的細(xì)胞株在體內(nèi)及體外均未觀察到潛在風(fēng)險(xiǎn)。在移植后2周,可觀察到標(biāo)記的種植于去細(xì)胞化的肝臟支架中的肝臟前體細(xì)胞在腎臟包膜下迅速增殖;免疫組化染色提示這些細(xì)胞具有肝細(xì)胞的部分功能,并觀察到血管新生。EGF可以加強(qiáng)再植的永生化的肝臟前體細(xì)胞的增殖和分化。
　　結(jié)論:使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染可以使肝臟前體細(xì)胞得到可逆性的安全的永生化狀態(tài),為肝臟細(xì)胞的大量獲取提供了來源,去細(xì)胞化的肝臟支架可以為肝臟前體細(xì)胞提供賴以生長的三維環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)、氧

13、分支持,EGF能促進(jìn)肝臟前體細(xì)胞在肝臟支架中的分化和增殖,肝臟前體細(xì)胞作為細(xì)胞成分而肝臟支架作為理想的支撐材料能應(yīng)用于肝臟細(xì)胞移植。
　　第三部分，去細(xì)胞化肝臟支架在胰島移植中的應(yīng)用研究
　　目的:獲取胰島細(xì)胞并測定其功能,探討胰島細(xì)胞在去細(xì)胞化的肝臟支架中的在體生長情況。
　　方法:使用膠原蛋白酶消化法以及非連續(xù)性梯度分離法獲得成年小鼠的胰腺,純化胰島細(xì)胞,在體外檢測胰島細(xì)胞的功能后,將胰島細(xì)胞灌注于去細(xì)胞化的肝臟支

14、架中,觀察其在腎臟包膜下的生長增殖情況。
　　結(jié)果:使用膠原蛋白酶消化法可以獲得大量的胰島,大約為150-200個(gè)胰島/小鼠。使用非連續(xù)性梯度分離法可以獲得純化的胰島,這些胰島在體外具有分泌胰島素的功能。將胰島細(xì)胞、種植于去細(xì)胞化肝臟中的胰島細(xì)胞移植于糖尿病小鼠中,發(fā)現(xiàn)胰島在去細(xì)胞化肝臟支架中能存活并發(fā)揮同普通胰島腎臟包膜下移植同樣的功能。
　　結(jié)論:使用膠原蛋白酶消化法可以有效獲得小鼠胰島細(xì)胞,去細(xì)胞化的肝臟支架可以為胰島