慢性乙型肝炎患者肝臟和外周血HBV特異性CTL表型和功能的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染嚴重威脅著人類的健康，全球有超過3.5億慢性感染患者，每年約50萬死于HBV相關性疾病。HBV是非細胞毒性嗜肝DNA病毒，它自身并不引起肝細胞損害，所造成的肝臟炎癥嚴重程度與肝內持續(xù)的HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)有關。因此研究HBV慢性感染中HBV特異性T淋巴細胞的特性，將為我們設計治療性乙肝疫苗提供新的思路。 活化的CTL通過兩條途徑清除病毒：

2、即胞溶途徑--分泌穿孔素、顆粒酶等細胞毒分子直接殺傷病毒感染的靶細胞或者Fas/FasL途徑介導靶細胞凋亡和非胞溶途徑--分泌細胞因子抑制病毒復制。急性HBV感染的患者體內兩種途徑都存在，外周血能檢測到較強的HBV表面抗原、核心抗原和多聚酶抗原特異性的CTL，絕大多數急性自限性感染患者都可以通過獲得性免疫和天然免疫的協調作用清除病毒而痊愈，并且獲得免疫力--保護抗體和HBV特異性記憶T淋巴細胞。 雖然慢性乙型肝炎患者外周血HBV

3、特異性細胞免疫反應很弱，但是在肝臟浸潤淋巴細胞中仍然可以分離和擴增到HBV特異性T淋巴細胞克隆，從低病毒滴度，HBeAg陰性的患者外周血也能檢測到少量HBV特異性CD8+T淋巴細胞，因此慢性乙型肝炎患者并不完全缺乏HBV特異性T淋巴細胞，卻不能有效的清除病毒。研究表明HBV特異性.T淋巴細胞存在功能障礙，分析它們功能障礙的原因，可能為我們治療HBV提供一定的線索。 HBV慢性感染導致CTL功能障礙的機制還沒有完全闡明，可能包括特

4、異性細胞剔除(耗竭、陰性選擇)或者細胞功能耐受(無能、免疫忽視)。嬰幼兒時期的垂直傳染可能導致HBV特異性T細胞克隆清除，而成年人感染初期大劑量病毒抗原則容易導致細胞耗竭，致使慢性感染患者體內病毒特異性T細胞數量減少。機體對病毒特異T細胞功能的抑制也是多方面的：HBV慢性感染患者CD4+CD25+Treg細胞的增加抑制了CD8+T淋巴細胞的功能；CD4+T細胞的缺乏或者Th2免疫偏離導致HBV特異性CD8+T淋巴細胞的成熟障礙；DC抗原

5、遞呈功能受損和DC1/DC2的失衡誘導T細胞的耐受等等。 CTL的功能與其分化發(fā)育的階段也是密切相關的。盡管對于記憶細胞是否來源于效應細胞的分化模式還存在分歧，但是急性感染免疫應答的三個階段是很明確的。CD8+T淋巴細胞大量活化的效應階段，效應細胞的凋亡階段，以及記憶細胞的形成階段。并且病毒清除后建立保護性免疫，記憶T淋巴細胞在不依賴抗原的方式下保持穩(wěn)態(tài)增殖，再次遭遇抗原能夠迅速活化。在此過程中，細胞表面分子表達的形式和數量也隨

6、之發(fā)生變化，根據不同的細胞表面分子，可以界定CD8+記憶T細胞的不同功能亞群。如隨著T細胞的分化和成熟，CD8+T細胞表達不同的共刺激分子(CD27、CD28、CD45RA)，根據它們的變化CD8+T淋巴細胞分為初始T細胞(CD27+CD28+CD45RA+)，記憶T細胞(CD27+CD28+CD45RA)和效應T細胞(CD27-CD28-CD45RA+)。CD27-CD28-CD45RA+/-和CD27lowCD28-CD45RA+/

7、-表型的CD8+T淋巴細胞有殺傷靶細胞的能力。CD8+T細胞功能的發(fā)揮和表型的分化成熟都伴隨著淋巴細胞不斷地遷移，因此不同時期趨化因子受體的表達也不相同。根據趨化因子受體CCR7的表達可以將細胞分為CCR7-的效應記憶細胞和CCR7+的中心記憶細胞，結合CD45RA還可以進一步將CD8+T細胞分為CD45RA+CCR7+(初始T細胞)，CD45RA-CCR7+(中心記憶T細胞)，CD45RA-CCR7-(效應記憶T細胞)和CD45RA+

8、CCR7-(終末分化效應細胞)。 然而慢性病毒感染可能改變記憶T細胞的分化狀態(tài)，或者阻礙T細胞的分化進程，從而影響T細胞的效應功能。慢性感染會改變病毒抗原的免疫優(yōu)勢性，急性感染中的亞優(yōu)勢表位誘導的免疫應答，在慢性感染中可能占據主導?？乖L期持續(xù)的存在可能影響到記憶T細胞的分布，急性感染中記憶細胞獲得歸巢受體后會回歸淋巴組織，而慢性感染中大量的病毒抗原特異性T淋巴細胞聚積在炎癥局部，不但影響了記憶細胞的形成，而且導致T細胞功能耗竭

9、。LCMV慢性感染的研究中就發(fā)現，隨著感染的慢性化進程，LCMV特異性T淋巴細胞逐漸失去分泌細胞因子能力、增殖能力和細胞毒效應功能，最終功能完全耗竭。基于共刺激分子CD27和CD28的研究發(fā)現各種病毒感染初期，特異性CD8+T細胞的分化表型變化不大，均為早期初始型，但是隨著感染慢性化，不同的病毒誘導T細胞分化停滯在不同階段，EB病毒和丙型肝炎病毒(HCV)特異性CD8+T細胞多為早期初始T細胞(CD27+CD28+)，而巨細胞病毒(CM

10、V)感染則富集晚期CD8+T細胞(CD27-CD28-)，人類免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8+T細胞多為中期亞群(CD27+CD28)。HIV、HCV特異性CD8細胞都因為分化發(fā)育障礙，嚴重影響了它們的功能。那么慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內HBV特異性T淋巴細胞是否也存在分化障礙呢? 最近大量的研究表明，PD-1/PD-L1信號途徑可能參與了慢性病毒感染中CTL的耗竭，阻斷這個信號通路可以恢復耗竭CD8細胞的功能。高表達抑

11、制受體PD-1可能是CD8細胞耗竭的標志。從HBeAg陰性的病毒載量低的慢性感染患者外周血中分離得到的HBV特異性T細胞體外Peptide刺激可以恢復其產生IFN-Y、細胞毒性及增殖反應的功能。經過拉米夫定治療的患者體內也發(fā)現HBV特異性CD8細胞頻率有所增加，并且Cr51殺傷實驗檢測到它們的細胞毒性功能也增強。這些證據都表明慢性乙型肝炎患者體內的HBV特異性CD8細胞的功能并沒有完全喪失，是可以逆轉的。那么PD-1/PD-L1信號途徑

12、是否也參與了HBV慢性感染導致病毒特異性T淋巴細胞功能低下的過程呢? PD-1分子是CD28免疫受體家族成員，廣泛表達在活化的B細胞、T細胞和骨髓細胞，以及CD4-CD8-T細胞表面，其N端含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)，C端含有免疫受體酪氨酸轉換基序(ITSM)。PD-1的表達和結構都提示它具有免疫調節(jié)功能。 PD-1最初的發(fā)現是作為負向調節(jié)信號參與維持自身抗原和腫瘤的耐受。PD-1缺陷小鼠自發(fā)產生自身免疫疾病

13、是PD-1參與免疫負向調節(jié)最直接的證據，而且SLE、RA和Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病患者也檢測到PD-1位點的單核苷酸多態(tài)性。PD-1在其他疾病中(如腫瘤、寄生蟲感染等)也發(fā)揮著負向免疫調節(jié)作用最近小鼠LCMV病毒慢性感染的研究中發(fā)現功能耗竭的LCMV特異性CD8+T細胞上調表達PD-1分子，PD-1/PD-L1信號途徑控制著CD8細胞的耗竭和抗病毒功能。阻斷慢性持續(xù)病毒感染的小鼠體內PD-1途徑不但可以恢復耗竭CD8細胞的功能(增殖能

14、力、分泌細胞因子和細胞毒功能)，而且促進小鼠更加有效的控制病毒。HIV病毒特異CD8+T細胞上也高表達PD-1，阻斷后同樣恢復細胞的功能。這個發(fā)現為慢性病毒感染的治療提供了新的希望。 已經有線索提示PD-1/PD-L1信號途徑可能在肝臟炎癥免疫應答中發(fā)揮重要的作用。 ①PD-L1基因敲除小鼠，抗原活化后的特異性CD8+T細胞在肝臟大量聚積，并且對ConA誘導的自身免疫性肝炎非常敏感。 ②PD-1缺陷小鼠感染腺病毒

15、時，在肝臟有大量抗原特異T細胞活化，迅速清除病毒。 ③病毒感染和外源性干擾素都可以上調肝細胞上PD-L1的表達，阻斷PD/PD-L1信號途徑可以阻斷肝細胞的凋亡。 ④最近HCV慢性感染研究發(fā)現HCV特異性CD8細胞的耗竭伴隨著PD-1的上調，并且持續(xù)表達。而HCV急性感染PD-1的上調表達是移過性的，當細胞獲得記憶表犁或者重新恢復功能后，PD-1表達下降。阻斷PD-1/PD-L1后病毒特異性CD8+T細胞增殖能力增加。

16、 到目前為止，HBV免疫應答的大多數工作都是研究外周血，但有證據表明慢性乙型肝炎患者肝臟內聚集了大量的HBV特異性CTL，因此研究慢性乙型肝炎患者肝臟內HBV特異性CTL的特性可能更為重要。 我們利用MHCⅠ-肽五聚體(Pentamer)技術直接離體檢測慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內浸潤淋巴細胞中HBV表位肽特異性CTL，結合流式和胞內細胞因子染色技術分析和比較慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內HBV特異性T淋巴細胞的活化、分

17、化、成熟表型和功能，并初步探討了PD-1分子與肝臟內HBV抗原特異性CTL功能低下的關系。 我們的實驗發(fā)現： (1)大多數慢性乙型肝炎患者肝臟局部都存在HBV特異性CTL； (2)肝內HBV特異性細胞表型多為CD45RA-CCR7-CD27+CD28+/-： (3)胞內細胞毒分子缺乏，增殖和分泌IFN-γ能力受損； (4)肝臟浸潤的HBV特異性CTL表面高表達PD-1分子。 實驗結果提示慢