慢性乙型肝炎患者肝臟和外周血HBV特異性CTL表型和功能的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染嚴(yán)重威脅著人類的健康，全球有超過3.5億慢性感染患者，每年約50萬死于HBV相關(guān)性疾病。HBV是非細(xì)胞毒性嗜肝DNA病毒，它自身并不引起肝細(xì)胞損害，所造成的肝臟炎癥嚴(yán)重程度與肝內(nèi)持續(xù)的HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)有關(guān)。因此研究HBV慢性感染中HBV特異性T淋巴細(xì)胞的特性，將為我們?cè)O(shè)計(jì)治療性乙肝疫苗提供新的思路。 活化的CTL通過兩條途徑清除病毒：

2、即胞溶途徑--分泌穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒分子直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞或者Fas/FasL途徑介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡和非胞溶途徑--分泌細(xì)胞因子抑制病毒復(fù)制。急性HBV感染的患者體內(nèi)兩種途徑都存在，外周血能檢測(cè)到較強(qiáng)的HBV表面抗原、核心抗原和多聚酶抗原特異性的CTL，絕大多數(shù)急性自限性感染患者都可以通過獲得性免疫和天然免疫的協(xié)調(diào)作用清除病毒而痊愈，并且獲得免疫力--保護(hù)抗體和HBV特異性記憶T淋巴細(xì)胞。 雖然慢性乙型肝炎患者外周血HBV

3、特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)很弱，但是在肝臟浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中仍然可以分離和擴(kuò)增到HBV特異性T淋巴細(xì)胞克隆，從低病毒滴度，HBeAg陰性的患者外周血也能檢測(cè)到少量HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞，因此慢性乙型肝炎患者并不完全缺乏HBV特異性T淋巴細(xì)胞，卻不能有效的清除病毒。研究表明HBV特異性.T淋巴細(xì)胞存在功能障礙，分析它們功能障礙的原因，可能為我們治療HBV提供一定的線索。 HBV慢性感染導(dǎo)致CTL功能障礙的機(jī)制還沒有完全闡明，可能包括特

4、異性細(xì)胞剔除(耗竭、陰性選擇)或者細(xì)胞功能耐受(無能、免疫忽視)。嬰幼兒時(shí)期的垂直傳染可能導(dǎo)致HBV特異性T細(xì)胞克隆清除，而成年人感染初期大劑量病毒抗原則容易導(dǎo)致細(xì)胞耗竭，致使慢性感染患者體內(nèi)病毒特異性T細(xì)胞數(shù)量減少。機(jī)體對(duì)病毒特異T細(xì)胞功能的抑制也是多方面的：HBV慢性感染患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞的增加抑制了CD8+T淋巴細(xì)胞的功能；CD4+T細(xì)胞的缺乏或者Th2免疫偏離導(dǎo)致HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的成熟障礙；DC抗原

5、遞呈功能受損和DC1/DC2的失衡誘導(dǎo)T細(xì)胞的耐受等等。 CTL的功能與其分化發(fā)育的階段也是密切相關(guān)的。盡管對(duì)于記憶細(xì)胞是否來源于效應(yīng)細(xì)胞的分化模式還存在分歧，但是急性感染免疫應(yīng)答的三個(gè)階段是很明確的。CD8+T淋巴細(xì)胞大量活化的效應(yīng)階段，效應(yīng)細(xì)胞的凋亡階段，以及記憶細(xì)胞的形成階段。并且病毒清除后建立保護(hù)性免疫，記憶T淋巴細(xì)胞在不依賴抗原的方式下保持穩(wěn)態(tài)增殖，再次遭遇抗原能夠迅速活化。在此過程中，細(xì)胞表面分子表達(dá)的形式和數(shù)量也隨

6、之發(fā)生變化，根據(jù)不同的細(xì)胞表面分子，可以界定CD8+記憶T細(xì)胞的不同功能亞群。如隨著T細(xì)胞的分化和成熟，CD8+T細(xì)胞表達(dá)不同的共刺激分子(CD27、CD28、CD45RA)，根據(jù)它們的變化CD8+T淋巴細(xì)胞分為初始T細(xì)胞(CD27+CD28+CD45RA+)，記憶T細(xì)胞(CD27+CD28+CD45RA)和效應(yīng)T細(xì)胞(CD27-CD28-CD45RA+)。CD27-CD28-CD45RA+/-和CD27lowCD28-CD45RA+/

7、-表型的CD8+T淋巴細(xì)胞有殺傷靶細(xì)胞的能力。CD8+T細(xì)胞功能的發(fā)揮和表型的分化成熟都伴隨著淋巴細(xì)胞不斷地遷移，因此不同時(shí)期趨化因子受體的表達(dá)也不相同。根據(jù)趨化因子受體CCR7的表達(dá)可以將細(xì)胞分為CCR7-的效應(yīng)記憶細(xì)胞和CCR7+的中心記憶細(xì)胞，結(jié)合CD45RA還可以進(jìn)一步將CD8+T細(xì)胞分為CD45RA+CCR7+(初始T細(xì)胞)，CD45RA-CCR7+(中心記憶T細(xì)胞)，CD45RA-CCR7-(效應(yīng)記憶T細(xì)胞)和CD45RA+

8、CCR7-(終末分化效應(yīng)細(xì)胞)。 然而慢性病毒感染可能改變記憶T細(xì)胞的分化狀態(tài)，或者阻礙T細(xì)胞的分化進(jìn)程，從而影響T細(xì)胞的效應(yīng)功能。慢性感染會(huì)改變病毒抗原的免疫優(yōu)勢(shì)性，急性感染中的亞優(yōu)勢(shì)表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在慢性感染中可能占據(jù)主導(dǎo)?？乖L(zhǎng)期持續(xù)的存在可能影響到記憶T細(xì)胞的分布，急性感染中記憶細(xì)胞獲得歸巢受體后會(huì)回歸淋巴組織，而慢性感染中大量的病毒抗原特異性T淋巴細(xì)胞聚積在炎癥局部，不但影響了記憶細(xì)胞的形成，而且導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭

9、。LCMV慢性感染的研究中就發(fā)現(xiàn)，隨著感染的慢性化進(jìn)程，LCMV特異性T淋巴細(xì)胞逐漸失去分泌細(xì)胞因子能力、增殖能力和細(xì)胞毒效應(yīng)功能，最終功能完全耗竭。基于共刺激分子CD27和CD28的研究發(fā)現(xiàn)各種病毒感染初期，特異性CD8+T細(xì)胞的分化表型變化不大，均為早期初始型，但是隨著感染慢性化，不同的病毒誘導(dǎo)T細(xì)胞分化停滯在不同階段，EB病毒和丙型肝炎病毒(HCV)特異性CD8+T細(xì)胞多為早期初始T細(xì)胞(CD27+CD28+)，而巨細(xì)胞病毒(CM

10、V)感染則富集晚期CD8+T細(xì)胞(CD27-CD28-)，人類免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8+T細(xì)胞多為中期亞群(CD27+CD28)。HIV、HCV特異性CD8細(xì)胞都因?yàn)榉只l(fā)育障礙，嚴(yán)重影響了它們的功能。那么慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內(nèi)HBV特異性T淋巴細(xì)胞是否也存在分化障礙呢? 最近大量的研究表明，PD-1/PD-L1信號(hào)途徑可能參與了慢性病毒感染中CTL的耗竭，阻斷這個(gè)信號(hào)通路可以恢復(fù)耗竭CD8細(xì)胞的功能。高表達(dá)抑

11、制受體PD-1可能是CD8細(xì)胞耗竭的標(biāo)志。從HBeAg陰性的病毒載量低的慢性感染患者外周血中分離得到的HBV特異性T細(xì)胞體外Peptide刺激可以恢復(fù)其產(chǎn)生IFN-Y、細(xì)胞毒性及增殖反應(yīng)的功能。經(jīng)過拉米夫定治療的患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)HBV特異性CD8細(xì)胞頻率有所增加，并且Cr51殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到它們的細(xì)胞毒性功能也增強(qiáng)。這些證據(jù)都表明慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的HBV特異性CD8細(xì)胞的功能并沒有完全喪失，是可以逆轉(zhuǎn)的。那么PD-1/PD-L1信號(hào)途徑

12、是否也參與了HBV慢性感染導(dǎo)致病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能低下的過程呢? PD-1分子是CD28免疫受體家族成員，廣泛表達(dá)在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，以及CD4-CD8-T細(xì)胞表面，其N端含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)，C端含有免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)。PD-1的表達(dá)和結(jié)構(gòu)都提示它具有免疫調(diào)節(jié)功能。 PD-1最初的發(fā)現(xiàn)是作為負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)參與維持自身抗原和腫瘤的耐受。PD-1缺陷小鼠自發(fā)產(chǎn)生自身免疫疾病

13、是PD-1參與免疫負(fù)向調(diào)節(jié)最直接的證據(jù)，而且SLE、RA和Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病患者也檢測(cè)到PD-1位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。PD-1在其他疾病中(如腫瘤、寄生蟲感染等)也發(fā)揮著負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用最近小鼠LCMV病毒慢性感染的研究中發(fā)現(xiàn)功能耗竭的LCMV特異性CD8+T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)PD-1分子，PD-1/PD-L1信號(hào)途徑控制著CD8細(xì)胞的耗竭和抗病毒功能。阻斷慢性持續(xù)病毒感染的小鼠體內(nèi)PD-1途徑不但可以恢復(fù)耗竭CD8細(xì)胞的功能(增殖能

14、力、分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒功能)，而且促進(jìn)小鼠更加有效的控制病毒。HIV病毒特異CD8+T細(xì)胞上也高表達(dá)PD-1，阻斷后同樣恢復(fù)細(xì)胞的功能。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為慢性病毒感染的治療提供了新的希望。 已經(jīng)有線索提示PD-1/PD-L1信號(hào)途徑可能在肝臟炎癥免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。 ①PD-L1基因敲除小鼠，抗原活化后的特異性CD8+T細(xì)胞在肝臟大量聚積，并且對(duì)ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎非常敏感。 ②PD-1缺陷小鼠感染腺病毒

15、時(shí)，在肝臟有大量抗原特異T細(xì)胞活化，迅速清除病毒。 ③病毒感染和外源性干擾素都可以上調(diào)肝細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)，阻斷PD/PD-L1信號(hào)途徑可以阻斷肝細(xì)胞的凋亡。 ④最近HCV慢性感染研究發(fā)現(xiàn)HCV特異性CD8細(xì)胞的耗竭伴隨著PD-1的上調(diào)，并且持續(xù)表達(dá)。而HCV急性感染PD-1的上調(diào)表達(dá)是移過性的，當(dāng)細(xì)胞獲得記憶表犁或者重新恢復(fù)功能后，PD-1表達(dá)下降。阻斷PD-1/PD-L1后病毒特異性CD8+T細(xì)胞增殖能力增加。

16、 到目前為止，HBV免疫應(yīng)答的大多數(shù)工作都是研究外周血，但有證據(jù)表明慢性乙型肝炎患者肝臟內(nèi)聚集了大量的HBV特異性CTL，因此研究慢性乙型肝炎患者肝臟內(nèi)HBV特異性CTL的特性可能更為重要。 我們利用MHCⅠ-肽五聚體(Pentamer)技術(shù)直接離體檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中HBV表位肽特異性CTL，結(jié)合流式和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)分析和比較慢性乙型肝炎患者外周血和肝臟內(nèi)HBV特異性T淋巴細(xì)胞的活化、分

17、化、成熟表型和功能，并初步探討了PD-1分子與肝臟內(nèi)HBV抗原特異性CTL功能低下的關(guān)系。 我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： (1)大多數(shù)慢性乙型肝炎患者肝臟局部都存在HBV特異性CTL； (2)肝內(nèi)HBV特異性細(xì)胞表型多為CD45RA-CCR7-CD27+CD28+/-： (3)胞內(nèi)細(xì)胞毒分子缺乏，增殖和分泌IFN-γ能力受損； (4)肝臟浸潤(rùn)的HBV特異性CTL表面高表達(dá)PD-1分子。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示慢