PD-L1特異性CAR基因的構建及CAR-T細胞的功能活性研究.pdf

1、繼手術，放療，化療后，腫瘤的免疫療法已成為第四種行之有效的治療手段，近期因發(fā)展迅速，而廣受關注。其中，嵌合抗原受體T細胞技術(Chimeric Antigen Receptors-T cell，CAR-T)是一種新興的過繼細胞療法(Adoptive cell transfer therapy，ACT)，該技術將患者的T細胞在體外修飾，活化和增殖后回輸到患者體內，通過T細胞表達的特異性受體，靶向性的識別腫瘤細胞，并顯示較強的殺傷活性和持久

2、性。PD-L1(Programmed deathligand-1)是程序性死亡分子1(Programmed death-1，PD-1)的配體，主要誘導性的表達在上皮細胞（如腫瘤細胞）和免疫細胞（如腫瘤浸潤淋巴細胞）等，在免疫應答負調控中發(fā)揮重要作用，PD-1/PD-L1信號通路的激活，有利于形成腫瘤微環(huán)境，使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視和免疫殺傷，而阻斷該信號通路，在一定程度上，促進可識別腫瘤抗原并產生特異性反應的T細胞增殖，發(fā)揮其殺

3、傷腫瘤細胞的作用。故本課題設計了PD-L1抗原特異CAR-T細胞，既可以阻斷PD-1/PD-L1信號通路，提高T細胞介導的腫瘤免疫治療，又可以特異性的殺死腫瘤細胞，并且構建的第三代CAR基因，可以增強殺傷的活性和持久性。
　　本研究構建了PD-L1(73-739)基因的原核表達載體，分離純化His-PD-L1融合蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用細胞融合技術和有限稀釋法，篩選獲得2株能夠穩(wěn)定分泌PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，雜

4、交瘤細胞腹腔接種BALB/c雌性小鼠，通過收集腹水制備并純化抗體，進行Westem Boltting驗證，利用ELISA法檢測，優(yōu)選其中一株雜交瘤細胞株，提取雜交瘤細胞總RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，PCR擴增單克隆抗體單鏈可變區(qū)片段，克隆片段經人源化替換與共刺激信號分子CD28、CD137和胞內信號分子CD3-ζ鏈的基因組合，構建并合成第三代CAR基因，將合成的CAR基因構建于慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGF

5、P上，慢病毒載體與包膜載體pLP1、pLP2以及包被載體pLP-VSVG按照優(yōu)化比例，利用脂質體3000共轉染到293T細胞完成慢病毒包裝，使用PEG濃縮法，獲得有活性的抗PD-L1慢病毒，使用CD8+磁珠分離外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)中的CD8+T細胞，經過體外刺激，慢病毒感染CD8+T細胞，待其擴增5d左右，進行CAR表達的測定，擴增20倍左右，利用非放射性細胞毒性