PD-L1特異性CAR基因的構(gòu)建及CAR-T細(xì)胞的功能活性研究.pdf

1、繼手術(shù)，放療，化療后，腫瘤的免疫療法已成為第四種行之有效的治療手段，近期因發(fā)展迅速，而廣受關(guān)注。其中，嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)(Chimeric Antigen Receptors-T cell，CAR-T)是一種新興的過繼細(xì)胞療法(Adoptive cell transfer therapy，ACT)，該技術(shù)將患者的T細(xì)胞在體外修飾，活化和增殖后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，通過T細(xì)胞表達(dá)的特異性受體，靶向性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并顯示較強(qiáng)的殺傷活性和持久

2、性。PD-L1(Programmed deathligand-1)是程序性死亡分子1(Programmed death-1，PD-1)的配體，主要誘導(dǎo)性的表達(dá)在上皮細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）和免疫細(xì)胞（如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞）等，在免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活，有利于形成腫瘤微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視和免疫殺傷，而阻斷該信號(hào)通路，在一定程度上，促進(jìn)可識(shí)別腫瘤抗原并產(chǎn)生特異性反應(yīng)的T細(xì)胞增殖，發(fā)揮其殺

3、傷腫瘤細(xì)胞的作用。故本課題設(shè)計(jì)了PD-L1抗原特異CAR-T細(xì)胞，既可以阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，提高T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療，又可以特異性的殺死腫瘤細(xì)胞，并且構(gòu)建的第三代CAR基因，可以增強(qiáng)殺傷的活性和持久性。
　　本研究構(gòu)建了PD-L1(73-739)基因的原核表達(dá)載體，分離純化His-PD-L1融合蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用細(xì)胞融合技術(shù)和有限稀釋法，篩選獲得2株能夠穩(wěn)定分泌PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，雜

4、交瘤細(xì)胞腹腔接種BALB/c雌性小鼠，通過收集腹水制備并純化抗體，進(jìn)行Westem Boltting驗(yàn)證，利用ELISA法檢測，優(yōu)選其中一株雜交瘤細(xì)胞株，提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，PCR擴(kuò)增單克隆抗體單鏈可變區(qū)片段，克隆片段經(jīng)人源化替換與共刺激信號(hào)分子CD28、CD137和胞內(nèi)信號(hào)分子CD3-ζ鏈的基因組合，構(gòu)建并合成第三代CAR基因，將合成的CAR基因構(gòu)建于慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGF

5、P上，慢病毒載體與包膜載體pLP1、pLP2以及包被載體pLP-VSVG按照優(yōu)化比例，利用脂質(zhì)體3000共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞完成慢病毒包裝，使用PEG濃縮法，獲得有活性的抗PD-L1慢病毒，使用CD8+磁珠分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)中的CD8+T細(xì)胞，經(jīng)過體外刺激，慢病毒感染CD8+T細(xì)胞，待其擴(kuò)增5d左右，進(jìn)行CAR表達(dá)的測定，擴(kuò)增20倍左右，利用非放射性細(xì)胞毒性