幽門螺桿菌烷基過氧化氫還原酶基因克隆、表達及多克隆抗體制備.pdf

1、Ahp為幽門螺桿菌烷基過氧化氫還原酶,屬于過氧化物酶家族,編碼的蛋白質分子量為23kD。由于在分解過氧化氫和相關的過氧化氫衍生物過程中起到非常關鍵的作用,ahpC基因主要催化生物體內有機過氧化氫物分解成乙醇,因此受到極大關注。AhpC是雙組分系統,由蛋白AhpF和AhpC組成。Wang等發(fā)現缺失ahpC基因的幽門螺桿菌突變株對氧化應激更加敏感,而抗氧化應激能力直接影響幽門螺桿菌在小鼠胃內定值。
　　本研究采用PCR方法獲得ahpC

2、基因全序列,并通過設計合適的酶切位點,構建原核表達載體。對篩選鑒定的陽性克隆進行誘導條件的優(yōu)化,使之高效表達融合蛋白,用Ni2+離子親和層析法純化融合蛋白,通過免疫日本大耳白兔制備抗融合蛋白的多克隆抗體。ELISA方法驗證多克隆抗體的效價。為下一步實驗驗證cagA基因對ahpC的作用奠定基礎。
　　方法:1.本研究結合pET-30a質粒載體特點,使用primer5.0引物設計軟件設計ahpC基因PCR引物,使上游引物帶NdeⅠ酶切

3、位點,下游引物帶XhoⅠ酶切位點。2.運用PCR技術從Hp27DNA中擴增ahpC基因,試劑盒回收ahpC DNA后,連接轉化入克隆載體pMD18-T中,驗證轉化效果。3.雙酶切重組克隆質粒pMD18-T-ahpC和原核表達載體pET-30a,酶切產物回收后,構建重組原核表達載體pET30a-ahpC,轉化入大腸桿菌BL21中進行陽性克隆篩選鑒定。4.本研究設立不同誘導條件,條件分別為不同的誘導時間和不同的IPTG濃度,對篩選出的陽性克

4、隆的誘導表達條件進行優(yōu)化。5.本實驗融合蛋白帶有6個His標簽的特性,使用Ni-NTA柱純化目的蛋白。6.純化后融合蛋白與弗氏佐劑超聲乳化混合,免疫日本大耳白兔,免疫4次,每次間隔7天。7.本研究采用心臟取血的方法,獲得日本大耳白兔的血清,運用ELISA方法檢測多克隆抗體的抗體效價。
　　結果:1.本實驗運用PCR方法擴增出ahpC基因,基因長度為594bp,將基因轉入克隆載體pMD—18T中,并轉入大腸桿菌DH5α中。2.本實驗

5、成功構建了ahpC原核表達載體pET30a-ahpC,并將其轉入大腸桿菌BL21中。3.對原核表達載體pET30a-ahpC的表達條件進行優(yōu)化,實驗發(fā)現原核表達載體在0.3mmol/l IPTG誘導5h時,蛋白表達量最高。4.本實驗通過離子親和層析柱純化融合蛋白,獲得了高純度的融合蛋白,蛋白質分子量為23000。5.本實驗使用融合蛋白免疫日本大耳白兔后,產生的多克隆抗體稀釋6400倍后,效價仍然達到17.33。
　　結論:1.本實