幽門螺桿菌烷基過(guò)氧化氫還原酶基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、Ahp為幽門螺桿菌烷基過(guò)氧化氫還原酶,屬于過(guò)氧化物酶家族,編碼的蛋白質(zhì)分子量為23kD。由于在分解過(guò)氧化氫和相關(guān)的過(guò)氧化氫衍生物過(guò)程中起到非常關(guān)鍵的作用,ahpC基因主要催化生物體內(nèi)有機(jī)過(guò)氧化氫物分解成乙醇,因此受到極大關(guān)注。AhpC是雙組分系統(tǒng),由蛋白AhpF和AhpC組成。Wang等發(fā)現(xiàn)缺失ahpC基因的幽門螺桿菌突變株對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感,而抗氧化應(yīng)激能力直接影響幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)定值。
　　本研究采用PCR方法獲得ahpC

2、基因全序列,并通過(guò)設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn),構(gòu)建原核表達(dá)載體。對(duì)篩選鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,使之高效表達(dá)融合蛋白,用Ni2+離子親和層析法純化融合蛋白,通過(guò)免疫日本大耳白兔制備抗融合蛋白的多克隆抗體。ELISA方法驗(yàn)證多克隆抗體的效價(jià)。為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證cagA基因?qū)hpC的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.本研究結(jié)合pET-30a質(zhì)粒載體特點(diǎn),使用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)ahpC基因PCR引物,使上游引物帶NdeⅠ酶切

3、位點(diǎn),下游引物帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)。2.運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp27DNA中擴(kuò)增ahpC基因,試劑盒回收ahpC DNA后,連接轉(zhuǎn)化入克隆載體pMD18-T中,驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效果。3.雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-ahpC和原核表達(dá)載體pET-30a,酶切產(chǎn)物回收后,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET30a-ahpC,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選鑒定。4.本研究設(shè)立不同誘導(dǎo)條件,條件分別為不同的誘導(dǎo)時(shí)間和不同的IPTG濃度,對(duì)篩選出的陽(yáng)性克

4、隆的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。5.本實(shí)驗(yàn)融合蛋白帶有6個(gè)His標(biāo)簽的特性,使用Ni-NTA柱純化目的蛋白。6.純化后融合蛋白與弗氏佐劑超聲乳化混合,免疫日本大耳白兔,免疫4次,每次間隔7天。7.本研究采用心臟取血的方法,獲得日本大耳白兔的血清,運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)多克隆抗體的抗體效價(jià)。
　　結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增出ahpC基因,基因長(zhǎng)度為594bp,將基因轉(zhuǎn)入克隆載體pMD—18T中,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中。2.本實(shí)驗(yàn)

5、成功構(gòu)建了ahpC原核表達(dá)載體pET30a-ahpC,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中。3.對(duì)原核表達(dá)載體pET30a-ahpC的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)載體在0.3mmol/l IPTG誘導(dǎo)5h時(shí),蛋白表達(dá)量最高。4.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離子親和層析柱純化融合蛋白,獲得了高純度的融合蛋白,蛋白質(zhì)分子量為23000。5.本實(shí)驗(yàn)使用融合蛋白免疫日本大耳白兔后,產(chǎn)生的多克隆抗體稀釋6400倍后,效價(jià)仍然達(dá)到17.33。
　　結(jié)論:1.本實(shí)