MiR-186靶向抑制胱硫醚-γ-裂解酶對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響.pdf

1、目的：富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞蓄積是動(dòng)脈粥樣硬化損傷的主要特征之一，主要發(fā)生在主動(dòng)脈分支處。有研究表明miR-186在心肌損傷和心肌梗死中高表達(dá)，同時(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中起重要作用，但其背后作用機(jī)制尚不明確。值得注意的是，在本課題組之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)H2S可以通過降低巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積及促炎因子的分泌改善動(dòng)脈粥樣硬化。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是心血管系統(tǒng)中H2S生成的關(guān)鍵限速酶。在本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-186能與CSE mR

2、NA3’UTR端結(jié)合。本課題的研究旨在探討miR-186是否通過靶向作用于CSE繼而促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌，并對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　方法：首先用生物信息學(xué)軟件分析miR-186與人源CSE mRNA3’UTR序列基本情況；接著利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)了miR-186與人源CSE mRNA3’UTR的結(jié)合情況，同時(shí)證實(shí)了miR-186確實(shí)能與人源CSE mRNA3’UTR結(jié)合；此外，我

3、們利用脂質(zhì)體2000分別將scrambledmiR-186、miR-186 mimic和miR-186 inhibitor轉(zhuǎn)染到THP-1泡沫源性巨噬細(xì)胞，用高效液相色譜法（HPLC）分別檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯（CE）、游離膽固醇（FC）及總膽固醇（TC）水平；Elisa檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子的含量變化；用Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CSE和LPL蛋白及mRNA的表達(dá)；采用亞甲基藍(lán)法結(jié)合分光光度儀檢測(cè)內(nèi)源性H2S

4、的含量。利用CSEsiRNA干擾CSE的表達(dá)，使其表達(dá)降低。
　　結(jié)果：通過生物信息學(xué)相關(guān)分析和雙熒光素報(bào)告酶基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-186恰好具有靶向調(diào)控CSE的生物信息學(xué)基礎(chǔ)，能直接抑制CSE蛋白和mRNA的表達(dá)。同時(shí)，我們分別利用高效液相色譜（HPLC）法和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-186能促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。有研究表明，上調(diào)CSE/H2S信號(hào)通路有顯著的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，基于此，推測(cè)miR-1

5、86可能是通過抑制CSE促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。由于CSE是心血管系統(tǒng)中內(nèi)源性H2S生成的關(guān)鍵限速酶，CSE mRNA和蛋白的表達(dá)水平的降低直接導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)H2S的生成量減少。而在本研究中內(nèi)源性H2S含量的變化，影響了THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)LPL mRNA和蛋白的表達(dá)，二者的變化呈負(fù)相關(guān)。而且巨噬細(xì)胞源性LPL是巨噬細(xì)胞泡沫化的一個(gè)重要因素，LPL活性及表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌。