小凹蛋白-1調(diào)節(jié)細(xì)胞外鈣敏感受體介導(dǎo)NO生成的作用機(jī)制.pdf

1、目的：1探討小凹蛋白-1(Cav-1)上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)鈣敏感受體(CaR)介導(dǎo)一氧化氮(NO)生成的作用機(jī)制。
　　方法：(1)胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)Ⅷ因子對(duì)其進(jìn)行抗原鑒定。(2)取2～5代HUVEC隨機(jī)分組：不同濃度f(wàn)ilipin處理組(1.5mg/L,2mg/L,2.5mg/L)，采用Westernblotting技術(shù)提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)Cav-1、e

2、NOS和p-eNOS蛋白的表達(dá)。(3)取2～5代細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組(Ca2+-free/HBS)；CaR激動(dòng)劑精胺(spermine,2mmol/L)+Ca2+組；Caveolae結(jié)構(gòu)破壞劑(filipin,1.5mg/L)+spermine+Ca2+組；Cav-1ShRNA+spermine+Ca2+組；空質(zhì)粒(Vehicle)+spermine+Ca2+組；Westernblotting技術(shù)檢測(cè)Cav-1、eNOS、p-eNOS總

3、蛋白和Cav-1、eNOS膜蛋白的表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)Cav-1和eNOS表達(dá)、共定位；免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)檢測(cè)Cav-1和eNOS相互作用。(4)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較用單因素方差分析，均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，以p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)Ⅷ證實(shí)原代培養(yǎng)的細(xì)胞為HUVEC。(2)HUVEC經(jīng)不

4、同濃度f(wàn)ilipin(1.5mg/L、2mg/L和2.5mg/L)處理后Cav-1、eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：各加藥組與Control組相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)總蛋白Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示：與Control組相比，spermine+Ca2+組和Vehicle+spermine+Ca2+組中p-eNOS蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與Control組和spermine+Ca2+組相比，

5、filipin或Cav-1干擾處理后，p-eNOS蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，Cav-1ShRNA組Cav-1蛋白表達(dá)亦減少(P<0.05)；各組eNOS蛋白表達(dá)均無(wú)差異(P>0.05)。(4)小凹(Caveolae)提取結(jié)果顯示：Cav-1和eNOS共定位于同一Caveolae區(qū)，filipin處理組Cav-1在Caveolae表達(dá)較對(duì)照組減少(P<0.05)。(5)膜蛋白提取結(jié)果如下：同Control組和spermine+Ca2+

6、組比較，filipin或Cav-1干擾處理后，Cav-1和eNOS膜蛋白表達(dá)均減少(P<0.05)。(6)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HUVEC中Cav-1與eNOS蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，兩者共定位于膜上，經(jīng)filipin處理后Cav-1和eNOS膜上定位減少，與eNOS在核周邊聚集明顯增多，Cav-1干擾后，eNOS亦較多聚集在核周邊。(7)Co-IP檢測(cè)結(jié)果如下：與Control組和spermine+Ca2+組比較，Cav-1ShRNA處理組Ca