黃芩苷抗CA46細(xì)胞及其裸鼠異種移植瘤的作用及相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的：(1)研究黃芩苷體外對(duì)人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株CA46增殖、凋亡的影響；黃芩苷聯(lián)合阿霉素(ADR)、柔紅霉素(DNR)、高三尖杉酯堿(HH)、依托泊甙(VP16)體外對(duì)CA46細(xì)胞的作用效果。(2)觀察黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。(3)磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(PI3K)／絲氨酸／蘇氨酸激酶(Akt)、絲裂原蛋白活化激酶(MAPK)(ERK1/2)信號(hào)通路在黃芩苷抑制CA46細(xì)胞增殖

2、及誘導(dǎo)凋亡中的作用。(4)研究黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的作用。 方法：(1)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用金氏公式評(píng)價(jià)黃芩苷聯(lián)合ADR、DNR、HH、VP16對(duì)CA46細(xì)胞的作用效果；AnnexinVFITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞DNA片段化檢測(cè)、TdT酶介導(dǎo)的末端缺失原位標(biāo)記(TUNEL)法和AO-EB熒光染色法檢測(cè)黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞凋亡的影

3、響；DNA倍體分析法檢測(cè)黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞周期的影響。(2)RT-PCR法檢測(cè)黃芩苷作用前后CA46細(xì)胞c-myc、bc1-2、bax、hTERT、pim-2、P21、Mc1-1、TGFβ1基因mRNA表達(dá)水平的變化；蛋白印跡(Westernblot)法檢測(cè)黃芩苷作用前后CA46細(xì)胞c-myc、bcl-2、procaspase-9、procaspase-3、PARP蛋白表達(dá)水平的變化以及PI3K/Akt和MAPK(ERK1/2)信號(hào)通

4、路蛋白表達(dá)水平的變化。(3)構(gòu)建CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組：陰性對(duì)照組、15mg/kg黃芩苷組、30mg/kg黃芩苷組、60mg/kg黃芩苷組、4mg/kgVP16陽性對(duì)照組、聯(lián)合用藥組(30mg/kg黃芩苷+2mg/kgVP16)。采用腹腔注射方式給藥12天后，處死部分裸鼠，稱量離體瘤塊重量，計(jì)算抑瘤率，對(duì)瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查觀察黃芩苷處理對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)的影響，采用透射電鏡法檢測(cè)黃芩苷

5、處理對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，提取瘤塊組織蛋白，進(jìn)行Akt、pAkt、mTOR和pmTOR的westernblot檢測(cè)，同時(shí)摘除眼球取血檢測(cè)血常規(guī)及肝腎功能，并取肝、脾、腎、心、肺做病理組織學(xué)檢查以觀察黃芩苷處理對(duì)裸鼠的毒性作用；繼續(xù)飼養(yǎng)各組未處死的裸鼠直至全部死亡(從給藥時(shí)間算起)，觀察黃芩苷處理對(duì)荷瘤裸鼠生存時(shí)間的影響。 結(jié)果：(1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩苷能有效抑制CA46細(xì)胞的增

6、殖，作用48小時(shí)的IC50約為10μM；以Q值和協(xié)同等級(jí)判斷，黃芩苷與VP16、ADR、DNR合用時(shí)，抗CA46細(xì)胞增殖的作用均明顯加強(qiáng)，且在低濃度尤其明顯，而黃芩苷與HH合用對(duì)CA46細(xì)胞增殖抑制率的提高作用不明顯；AnnexinVFITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞DNA片段化檢測(cè)、TUNEL法和AO-EB熒光染色法檢測(cè)證實(shí)黃芩苷能誘導(dǎo)CA46細(xì)胞凋亡，且隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也逐漸上升；DNA倍體分析證實(shí)黃芩苷能使CA46細(xì)胞

7、周期阻滯于G0/G1期。(2)黃芩苷的作用下調(diào)了CA46細(xì)胞c-myc、bc1-2、hTERT、pim2、Mc1-1基因mRNA和／或蛋白的表達(dá)，上調(diào)了bax、P21、TGFβ1基因mRNA的表達(dá)；Westernblot結(jié)果顯示procaspase-9、procaspase-3、PARP(116KD)蛋白的表達(dá)水平下降，而PARP蛋白的85KD裂解活性片段逐漸升高。(3)黃芩苷的作用下調(diào)了CA46細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白pAk

8、t、pIKB、NF-KB、mTOR、pmTOR、pGSK-3B的表達(dá)，而對(duì)Akt、IKB、GSK-3β的表達(dá)無明顯影響：下調(diào)了MAPK(ERK1/2)信號(hào)通路蛋白pMAPK(44/42)的表達(dá)，而對(duì)MAPK(44/42)的表達(dá)無明顯影響。(4)腹腔注射給藥12天后，稱量離體瘤塊的重量結(jié)果顯示：當(dāng)黃芩苷劑量為15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg時(shí)，瘤塊重量分別為1.71±0.17g(P>0.05)、1.35±0.35g(P<0.

9、05)和0.97±0.38g(P<0.01)，說明黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴性的明顯抑制作用；將30mg/kg黃芩苷和2mg/kgVP16聯(lián)合使用時(shí)，抑瘤率達(dá)60.4％，高于單用4mg/kgVP16陽性對(duì)照組的51.1％和單用60mg/kg黃芩苷組的46.7％，提示黃芩苷與VP16具有協(xié)同抗CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的作用。對(duì)瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)和透射電鏡檢查的結(jié)果表明：黃芩苷用藥組和聯(lián)合用藥組的腫瘤壞死區(qū)域和

10、腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較陰性對(duì)照組多見，且黃芩苷用藥組中以高劑量組的效果最為明顯。對(duì)提取的瘤塊組織蛋白進(jìn)行westernblot檢測(cè)的結(jié)果表明：高劑量黃芩苷組和聯(lián)合用藥組除Akt蛋白的表達(dá)無明顯改變外，pAkt、mTOR和pmTOR蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示黃芩苷體內(nèi)抗腫瘤作用的機(jī)制亦可能與下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。對(duì)荷瘤裸鼠生存時(shí)間的觀察結(jié)果表明：隨著黃芩苷劑量的增加，荷瘤裸鼠的生存時(shí)間得到提高，低、中、高劑量組的中位

11、生存時(shí)間分別為48天、58天、72天，而陰性對(duì)照組的中位生存時(shí)間僅53天；黃芩苷和VP16合用對(duì)荷瘤裸鼠生存時(shí)間的提高作用最明顯，聯(lián)合用藥組的中位生存時(shí)間達(dá)88天，與陰性對(duì)照組相比較具有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：(1)黃芩苷體外能有效抑制CA46細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)其凋亡。其機(jī)制可能與下調(diào)c-myc、bcl-2、h-tert、pim-2、Mcl-1基因mRNA和／或蛋白的表達(dá)，上調(diào)

12、bax、P21、TGFβ1基因mRNA的表達(dá)有關(guān)。(2)黃芩苷與一些化療藥物如VP16、ADR和DNR聯(lián)用，具有體外協(xié)同抗CA46細(xì)胞的作用。(3)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt、MAPK(ERKl/2)信號(hào)通路參與了黃芩苷抑制CA46細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的過程。(4)黃芩苷可抑制CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)瘤組織中CA46細(xì)胞的凋亡，與VP16合用可明顯提高荷瘤裸鼠的生存時(shí)間，其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt/mT