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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
Burkitt's淋巴瘤是一種侵襲性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤,疾病進(jìn)展快,死亡率高。雖然隨著化療及免疫治療等研究的進(jìn)展,Burkitt's淋巴瘤患者的治療效果已有明顯改善,但復(fù)發(fā)及大劑量化療的毒副作用仍是影響淋巴瘤腫瘤療效進(jìn)一步提高的主要障礙;而新的分子靶向治療藥物也存在價(jià)格昂貴和耐藥問(wèn)題,從價(jià)廉且毒副作用小的傳統(tǒng)藥物中開(kāi)發(fā)具有抗淋巴瘤活性的“新用途”越來(lái)越引起重視。
Disulfiram(DS)是一種能
2、夠抑制醇脫氫酶的二硫代氨基甲酸鹽藥物,已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用于抗酗酒,安全低毒且價(jià)格低廉。已有研究報(bào)道DS還具有抗腫瘤效應(yīng),它對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用,另外,我們過(guò)去的研究也證實(shí)DS對(duì)白血病細(xì)胞具有抗腫瘤作用。DS作為一種二價(jià)金屬離子螯合物,能夠與Cu離子螯合形成DS/Cu復(fù)合物,DS/Cu能顯著提高DS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。但有關(guān)DS及DS聯(lián)合Cu對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制尚不明確,因
3、此需進(jìn)一步探索其作用及分子機(jī)制。
有關(guān)DS抗腫瘤作用機(jī)制的研究近年取得了不少新進(jìn)展,尤其在促凋亡機(jī)制方面,發(fā)現(xiàn)與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)?;钚匝?ROS)包括過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)及脂質(zhì)過(guò)氧化物等,ROS不僅可作為一種毒性物質(zhì)介導(dǎo)炎性損傷,近年發(fā)現(xiàn)它還是信息家族分子中的重要成員之一,對(duì)細(xì)胞具有廣泛的調(diào)節(jié)功能,在細(xì)胞凋亡中具有重要意義。ROS是細(xì)胞凋亡的早期信號(hào),它可作用于線粒體,促使線粒
4、體膜通透性改變、細(xì)胞色素C釋放,還能與caspase9前體、ATP/dATP形成凋亡體,然后激活caspase3、caspase9,進(jìn)而誘發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),使DNA斷裂,引起細(xì)胞凋亡,而損傷的線粒體能產(chǎn)生更多活性氧,進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。研究表明腫瘤細(xì)胞ROS水平略高于正常細(xì)胞,但由于有效的抗氧化機(jī)制的存在,腫瘤細(xì)胞對(duì)相對(duì)高水平的ROS是可以耐受。但在刺激信號(hào)作用下ROS進(jìn)一步升高,可觸發(fā)線粒體跨膜電勢(shì)降低,使線粒體釋放細(xì)胞色素C
5、而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
C-Jun氨基末端激酶(JNK)是MAPK重要成員之一,JNK也是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡激活的通路之一,活化的JNK能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,特別是各種應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。C-jun蛋白是JNK的作用底物,在外界作用刺激下,JNK表達(dá)上調(diào)或磷酸化水平上調(diào)將通過(guò)誘導(dǎo)C-Jun蛋白的氨基末端發(fā)生磷酸化,作為凋亡信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)部,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。在眾多的外界應(yīng)激因素中活性氧是非常常見(jiàn)的一種,近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ROS的大量產(chǎn)生使得J
6、NK持續(xù)激活,最終導(dǎo)致細(xì)胞由生存走向死亡。因此JNK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及活性氧在這一途徑中的作用可能是DS誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要分子機(jī)制。
在多種腫瘤細(xì)胞中,NF-κB是活化的,NF-κB能夠調(diào)控許多對(duì)腫瘤細(xì)胞存活、分化和凋亡非常重要的基因的表達(dá)。通常所指的NF-κB為P50/P65異源二聚體,調(diào)控下游一系列抗凋亡基因的表達(dá)。抑制P65的活性可抑制由NF-κB所啟動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制,最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋
7、亡。已有研究發(fā)現(xiàn)DS/Cu可普遍抑制NF-κB的表達(dá)水平,從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。另外,有研究報(bào)道ROS可抑制NF-κB的激活。因此,ROS抑制NF-κB的活化可能增強(qiáng)JNK活化的促凋亡作用。
Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,生理狀態(tài)下Nrf2與胞質(zhì)蛋白伴侶分子keap1結(jié)合使活性處于相對(duì)抑制狀態(tài),氧化應(yīng)激作用下導(dǎo)致Nrf2與Keap1解耦聯(lián),活化Nrf2轉(zhuǎn)移入核內(nèi),調(diào)控其下游第Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及某些藥
8、物轉(zhuǎn)運(yùn)泵等靶基因的表達(dá),保護(hù)基因免受損傷,與腫瘤耐藥密切相關(guān)。而研究發(fā)現(xiàn)高水平的ROS可破壞具有抗氧化作用的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活性,因而進(jìn)一步增強(qiáng)ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。促進(jìn)ROS生成及抑制Nrf2活性有望成為抗腫瘤治療的有效方法之一。
本研究以Raji細(xì)胞及雌性、四周齡BALB/C裸鼠為研究對(duì)象,研究DS及DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響及其與ROS/Nrf2、JNK及NF-κB通路的關(guān)系;同時(shí)進(jìn)一步觀察DS及DS/
9、Cu對(duì)Raji細(xì)胞BALB/C裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響,為將來(lái)臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的:
本課題以Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞和BALB/C裸鼠為研究對(duì)象,探討DS/Cu能否在體外誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡并抑制其增殖,明確DS/Cu對(duì)Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。進(jìn)一步從ROS/Nrf2、JNK、以及NF-κB通路探討其潛在的分子機(jī)制。
方法:
1、
10、細(xì)胞株:人B細(xì)胞淋巴瘤(Burkitt's)細(xì)胞株Raji。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性、4周齡BALB/C裸鼠,購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
3、MTT法評(píng)價(jià)濃度分別為0.05、0.125、0.25、1.25、2.5μM的DS及上述濃度DS聯(lián)合Cu作用72小時(shí)后對(duì)Raji細(xì)胞株的體外增殖抑制作用,明確DS和DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞株的IC50。
4、Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)
11、照組、DS組(DS: IC50-Ds)、DS/Cu組(DS: IC50-Ds,Cu:1μm)分別作用Raji細(xì)胞6h、12h、24h后的凋亡細(xì)胞比例。
5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、DS組(DS: IC50-Ds)、DS/Cu組(DS: IC50-DS,Cu:1μm)分別作用Raji細(xì)胞6h、12h、24h后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。
6、1) Western Blotting檢測(cè)對(duì)照組、Cu組(1μm)、DS組(DS
12、: IC50-Ds)、DS/Cu組(DS: IC50-DS,Cu:1μm)作用24小時(shí)后Raji細(xì)胞內(nèi)P65、作用1小時(shí)后磷酸化JNK(P-JNK)表達(dá)水平變化,作用6小時(shí)后其下游分子C-jun蛋白表達(dá)變化。
2) Western Blotting檢測(cè)上述各個(gè)處理組分別作用6小時(shí)、12小時(shí)及24小時(shí)后Raji細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)變化。
3) Western Blotting檢測(cè)對(duì)照組、DS組(DS:IC5
13、0-Ds)、DS/Cu組(DS: IC50-DS,Cu:1μn)、DS/Cu/NAC組(DSF:IC50-DS,Cu:1μmn,NAC:10mM)四組作用24小時(shí)后Raji細(xì)胞C-jun、Nrf2和p65蛋白表達(dá)變化。
7、1)建立動(dòng)物模型:24只裸鼠接種前2天每只全身給予2GyX射線照射2min,于裸鼠背部近腋下處皮下接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raji細(xì)胞3×107個(gè),液體總量為0.2ml,每2天觀察活動(dòng)情況和體重。
14、2)分組及藥物治療干預(yù):將18只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組、DS單藥組、DS聯(lián)合Cu組,每組6只。DS組6只裸鼠分別于(+1d~+5d,+,8d~+12d)灌胃口服DS3mg/20g(液體總量200μl),DS/Cu組6只裸鼠分別于(+1d~+5d,+,8d~+12d)灌胃口服DS3mg/20g(液體總量100μl)、Cu0.17mg/20g(液體總量100μl),對(duì)照組灌胃口服同樣劑量的生理鹽水。
3)療效評(píng)價(jià):從
15、首次給藥前起每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大垂直徑,根據(jù)長(zhǎng)×寬2×0.5計(jì)算腫瘤體積(Tumor Volume,TV),比較各組治療后腫瘤體積。連續(xù)給藥結(jié)束后24小時(shí),頸椎脫臼法處死裸鼠,將移植留完整切除,并稱其重量,比較各組治療后腫瘤重量。將剝除腫瘤置于10%的中性福爾馬林中固定24h,用梯度增高的酒精置換出組織內(nèi)水分,石蠟包埋,并切成4μm厚度的石蠟切片。石蠟切片用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,蘇木素-伊紅染色,樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀
16、察移植瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
4)組織蛋白勻漿后,提取蛋白,BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。Western blotting檢測(cè)空白組、DS組及DS/Cu組Nrf2及P65蛋白表達(dá)變化。
8、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間均數(shù)的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法;配對(duì)劑量資料的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較使用析因分析和單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì),在方差分析顯著的情況下使用Bonferron
17、i(方差齊性)進(jìn)行多重比較;若方差不齊則采用近似F檢驗(yàn)(如Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法進(jìn)行多重比較;計(jì)量資料用x±S表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
結(jié)果:
1、DS和DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞在體外具有明顯抑制增殖的作用:
不同濃度的DS作用于Raji細(xì)胞72h后結(jié)果顯示細(xì)胞存活率均有不同程度的下降,且呈劑量依賴性,其IC50濃度為(0.793±0.08)μM。上述不
18、同濃度DS分別與濃度1μM Cu2+溶液聯(lián)合后對(duì)Raji細(xì)胞增殖抑制作用顯著增強(qiáng),IC50濃度降為(0.085±0.015)μM。DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞的IC50顯著低于DS單藥,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.110、P=0.000),提示Cu可顯著增強(qiáng)DS對(duì)Raji細(xì)胞的增殖抑制作用。
2、DS和DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用:
根據(jù)MTT和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取24小時(shí)IC50濃度的DS(DS:3.3
19、μM)及上述濃度的DS聯(lián)合Cu(Cu2+:1μM)分別作用Raji細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后觀察細(xì)胞凋亡比例變化。結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示,DS和DS/Cu分別作用于Raji細(xì)胞時(shí)間主效應(yīng)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.990,P=0.001)。隨作用時(shí)間延長(zhǎng),Raji細(xì)胞凋亡比例逐漸升高,凋亡比例表現(xiàn)時(shí)間依賴性,不同時(shí)間點(diǎn)DS及DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例均高于對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)一步運(yùn)用單因素方差分析比較不同處理組細(xì)胞凋亡率的差異
20、,不同時(shí)間點(diǎn)DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),24小時(shí)DS組凋亡細(xì)胞比例高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),12小時(shí)和24小時(shí)DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例顯著高于DS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示DS和DS/Cu對(duì)Raji細(xì)胞均存在誘導(dǎo)凋亡的能力,但DS/Cu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯強(qiáng)于DS。
3、DS和DS/Cu對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響:
21、 選取24小時(shí)IC50濃度的DS(DS:3.3μM)及上述濃度的DS聯(lián)合Cu(Cu2+:1μM)分別作用Raji細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示,DS和DS/Cu分別作用于Raji細(xì)胞時(shí)間主效應(yīng)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=10.252,P<0.001)。隨作用時(shí)間延長(zhǎng),Raji細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,不同時(shí)間點(diǎn)的DS或者DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積的能力均高
22、于對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)一步運(yùn)用單因素方差分析比較不同處理組ROS水平的差異,不同時(shí)間點(diǎn)DS和DS/Cu組ROS生成水平均顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),12小時(shí)和24小時(shí)DS/Cu組ROS水平高于DS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明DS和DS/Cu均能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積,但DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積的能力明顯強(qiáng)于DS單藥。
4、Western blotting
23、檢測(cè)JNK通路蛋白及P65蛋白表達(dá)變化:
共設(shè)立空白對(duì)照組、Cu單藥組、DS單藥組及DS/Cu聯(lián)合組,作用Raji細(xì)胞1小時(shí)后,western blotting結(jié)果顯示DS和DS/Cu處理組Raji細(xì)胞內(nèi)磷酸化.JNK(P-JNK)表達(dá)水平顯著增加,作用6小時(shí)后其下游分子C-jun表達(dá)水平較其他組顯著增加,其中DS/Cu組上調(diào)更明顯。同樣以western blotting檢測(cè)作用Raji細(xì)胞24小時(shí)候細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白表達(dá)
24、變化,DS和DS/Cu組P65蛋白表達(dá)均有下調(diào),同樣DS/Cu組P65蛋白下調(diào)更加明顯。
5、Western blotting檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)變化:
設(shè)立空白對(duì)照組、Cu單藥組、DS單藥組及DS/Cu聯(lián)合組,分別作用Raji細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)及24小時(shí)后,western blotting結(jié)果顯示作用6小時(shí)和12小時(shí)后,DS及DS/Cu組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加;但當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至24
25、小時(shí),DS及DS/Cu組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組反而顯著下降,且DS/Cu組Nrf2蛋白表達(dá)水平下調(diào)更加明顯。
6、Western blotting檢測(cè)加入ROS抑制劑NAC后C-jun、P65及Nrf2蛋白表達(dá)變化:
Western blotting結(jié)果顯示加入ROS抑制劑NAC后DS/Cu組對(duì)C-jun蛋白表達(dá)上調(diào)及P65及Nrf2蛋白表達(dá)下調(diào)的作用均可以被NAC不同程度的抑制。
26、 7、成功建立Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤模型:
移植成瘤率75%。中位成瘤時(shí)間6天(5-8天),各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)按計(jì)劃結(jié)束前無(wú)裸鼠死亡。
8、DS和DS/Cu對(duì)Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用:
接種細(xì)胞后第6天、開(kāi)始干預(yù)前移植瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),荷瘤鼠體重差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌胃用藥后,DS和DS/Cu組的
27、裸鼠移植瘤的體積和重量均顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028和P=0.011;P=0.019和P=0.005)。DS/Cu組的瘤體體積和重量與DS組比較,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植瘤標(biāo)本經(jīng)HE染色后顯示,對(duì)照組腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)均較用藥組豐富,實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞出現(xiàn)核內(nèi)致密質(zhì)塊、核碎裂或核固縮,嗜酸性染色增強(qiáng)。提示這些細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)了凋亡的改變,DS/Cu組較明顯。
9、Western blotti
28、ng檢測(cè)治療后裸鼠移植瘤組織中Nrf2及P65蛋白表達(dá)改變:移植瘤組織提取的蛋白質(zhì)經(jīng)Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示DS及DS/Cu組P65及Nrf2蛋白表達(dá)均下調(diào),其中DS/Cu組下調(diào)更加顯著。
結(jié)論:
1、DS單藥對(duì)Raji細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用,Cu可顯著增強(qiáng)DS抑制Raji細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。
2、DS和DS/Cu均可促進(jìn)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS生成,DS/Cu作
29、用更加顯著,且細(xì)胞內(nèi)ROS增加呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)。
3、DS單藥和DS/Cu能夠增加Raji細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK(P-JNK)和c-jun蛋白表達(dá)水平,下調(diào)NF-κ B通路中P65蛋白表達(dá)水平,提示活化JNK/c-Jun通路及抑制NF-κ B通路是DS/Cu殺傷Raji細(xì)胞的重要機(jī)制之一。
4、12小時(shí)內(nèi)隨著DS單藥和DS/Cu作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞保護(hù)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達(dá)水平也增加,與細(xì)胞內(nèi)ROS增多成對(duì)應(yīng)關(guān)
30、系。但作用24小時(shí)后Nrf2蛋白表達(dá)水平反而下調(diào),其中DS/Cu組下調(diào)更加顯著,而ROS水平繼續(xù)升高。提示ROS在細(xì)胞內(nèi)的大量蓄積超過(guò)閾值,能夠抑制Nrf2的活化,促進(jìn)DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。
5、ROS抑制劑NAC能抑制DSF/Cu對(duì)C-jun、P65和Nrf2蛋白表達(dá)的影響,提示ROS與JNK、NF-κB和Nrf2通路之間的相互作用可能是DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。
6、DS及
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