Disulfiram聯(lián)合Cu對Raji細(xì)胞及其裸鼠移植瘤生長的影響及分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景:
　　 Burkitt's淋巴瘤是一種侵襲性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，疾病進(jìn)展快，死亡率高。雖然隨著化療及免疫治療等研究的進(jìn)展，Burkitt's淋巴瘤患者的治療效果已有明顯改善，但復(fù)發(fā)及大劑量化療的毒副作用仍是影響淋巴瘤腫瘤療效進(jìn)一步提高的主要障礙;而新的分子靶向治療藥物也存在價格昂貴和耐藥問題，從價廉且毒副作用小的傳統(tǒng)藥物中開發(fā)具有抗淋巴瘤活性的“新用途”越來越引起重視。
　　 Disulfiram(DS)是一種能

2、夠抑制醇脫氫酶的二硫代氨基甲酸鹽藥物，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用于抗酗酒，安全低毒且價格低廉。已有研究報(bào)道DS還具有抗腫瘤效應(yīng)，它對乳腺癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，另外，我們過去的研究也證實(shí)DS對白血病細(xì)胞具有抗腫瘤作用。DS作為一種二價金屬離子螯合物，能夠與Cu離子螯合形成DS/Cu復(fù)合物，DS/Cu能顯著提高DS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。但有關(guān)DS及DS聯(lián)合Cu對淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制尚不明確，因

3、此需進(jìn)一步探索其作用及分子機(jī)制。
　　 有關(guān)DS抗腫瘤作用機(jī)制的研究近年取得了不少新進(jìn)展，尤其在促凋亡機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)與多條信號傳導(dǎo)通路有關(guān)?；钚匝?ROS)包括過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)及脂質(zhì)過氧化物等，ROS不僅可作為一種毒性物質(zhì)介導(dǎo)炎性損傷，近年發(fā)現(xiàn)它還是信息家族分子中的重要成員之一，對細(xì)胞具有廣泛的調(diào)節(jié)功能，在細(xì)胞凋亡中具有重要意義。ROS是細(xì)胞凋亡的早期信號，它可作用于線粒體，促使線粒

4、體膜通透性改變、細(xì)胞色素C釋放，還能與caspase9前體、ATP/dATP形成凋亡體，然后激活caspase3、caspase9，進(jìn)而誘發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，使DNA斷裂，引起細(xì)胞凋亡，而損傷的線粒體能產(chǎn)生更多活性氧，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。研究表明腫瘤細(xì)胞ROS水平略高于正常細(xì)胞，但由于有效的抗氧化機(jī)制的存在，腫瘤細(xì)胞對相對高水平的ROS是可以耐受。但在刺激信號作用下ROS進(jìn)一步升高，可觸發(fā)線粒體跨膜電勢降低，使線粒體釋放細(xì)胞色素C

5、而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 C-Jun氨基末端激酶(JNK)是MAPK重要成員之一，JNK也是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡激活的通路之一，活化的JNK能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，特別是各種應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。C-jun蛋白是JNK的作用底物，在外界作用刺激下，JNK表達(dá)上調(diào)或磷酸化水平上調(diào)將通過誘導(dǎo)C-Jun蛋白的氨基末端發(fā)生磷酸化，作為凋亡信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)部，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。在眾多的外界應(yīng)激因素中活性氧是非常常見的一種，近來研究發(fā)現(xiàn)ROS的大量產(chǎn)生使得J

6、NK持續(xù)激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞由生存走向死亡。因此JNK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及活性氧在這一途徑中的作用可能是DS誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的一個重要分子機(jī)制。
　　 在多種腫瘤細(xì)胞中，NF-κB是活化的，NF-κB能夠調(diào)控許多對腫瘤細(xì)胞存活、分化和凋亡非常重要的基因的表達(dá)。通常所指的NF-κB為P50/P65異源二聚體，調(diào)控下游一系列抗凋亡基因的表達(dá)。抑制P65的活性可抑制由NF-κB所啟動的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞的生長受到抑制，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋

7、亡。已有研究發(fā)現(xiàn)DS/Cu可普遍抑制NF-κB的表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。另外，有研究報(bào)道ROS可抑制NF-κB的激活。因此，ROS抑制NF-κB的活化可能增強(qiáng)JNK活化的促凋亡作用。
　　 Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下Nrf2與胞質(zhì)蛋白伴侶分子keap1結(jié)合使活性處于相對抑制狀態(tài)，氧化應(yīng)激作用下導(dǎo)致Nrf2與Keap1解耦聯(lián)，活化Nrf2轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，調(diào)控其下游第Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及某些藥

8、物轉(zhuǎn)運(yùn)泵等靶基因的表達(dá)，保護(hù)基因免受損傷，與腫瘤耐藥密切相關(guān)。而研究發(fā)現(xiàn)高水平的ROS可破壞具有抗氧化作用的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活性，因而進(jìn)一步增強(qiáng)ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。促進(jìn)ROS生成及抑制Nrf2活性有望成為抗腫瘤治療的有效方法之一。
　　 本研究以Raji細(xì)胞及雌性、四周齡BALB/C裸鼠為研究對象，研究DS及DS/Cu對Raji細(xì)胞生長和凋亡的影響及其與ROS/Nrf2、JNK及NF-κB通路的關(guān)系;同時進(jìn)一步觀察DS及DS/

9、Cu對Raji細(xì)胞BALB/C裸鼠移植瘤生長的影響，為將來臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 本課題以Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞和BALB/C裸鼠為研究對象，探討DS/Cu能否在體外誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，明確DS/Cu對Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生長的影響。進(jìn)一步從ROS/Nrf2、JNK、以及NF-κB通路探討其潛在的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、

10、細(xì)胞株:人B細(xì)胞淋巴瘤(Burkitt's)細(xì)胞株Raji。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動物:雌性、4周齡BALB/C裸鼠，購自廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心。
　　 3、MTT法評價濃度分別為0.05、0.125、0.25、1.25、2.5μM的DS及上述濃度DS聯(lián)合Cu作用72小時后對Raji細(xì)胞株的體外增殖抑制作用，明確DS和DS/Cu對Raji細(xì)胞株的IC50。
　　 4、Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測對

11、照組、DS組(DS: IC50-Ds)、DS/Cu組（DS: IC50-Ds，Cu:1μm）分別作用Raji細(xì)胞6h、12h、24h后的凋亡細(xì)胞比例。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測對照組、DS組(DS: IC50-Ds)、DS/Cu組(DS: IC50-DS，Cu:1μm)分別作用Raji細(xì)胞6h、12h、24h后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。
　　 6、1) Western Blotting檢測對照組、Cu組（1μm）、DS組(DS

12、: IC50-Ds)、DS/Cu組（DS: IC50-DS，Cu:1μm）作用24小時后Raji細(xì)胞內(nèi)P65、作用1小時后磷酸化JNK(P-JNK)表達(dá)水平變化，作用6小時后其下游分子C-jun蛋白表達(dá)變化。
　　 2) Western Blotting檢測上述各個處理組分別作用6小時、12小時及24小時后Raji細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)變化。
　　 3) Western Blotting檢測對照組、DS組（DS:IC5

13、0-Ds）、DS/Cu組(DS: IC50-DS，Cu:1μn)、DS/Cu/NAC組(DSF:IC50-DS,Cu:1μmn,NAC:10mM)四組作用24小時后Raji細(xì)胞C-jun、Nrf2和p65蛋白表達(dá)變化。
　　 7、1)建立動物模型:24只裸鼠接種前2天每只全身給予2GyX射線照射2min，于裸鼠背部近腋下處皮下接種對數(shù)生長期Raji細(xì)胞3×107個，液體總量為0.2ml，每2天觀察活動情況和體重。
　　

14、2)分組及藥物治療干預(yù):將18只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組:空白對照組、DS單藥組、DS聯(lián)合Cu組，每組6只。DS組6只裸鼠分別于(+1d～+5d，+，8d～+12d)灌胃口服DS3mg/20g(液體總量200μl)，DS/Cu組6只裸鼠分別于(+1d～+5d，+，8d～+12d)灌胃口服DS3mg/20g（液體總量100μl）、Cu0.17mg/20g（液體總量100μl），對照組灌胃口服同樣劑量的生理鹽水。
　　 3)療效評價:從

15、首次給藥前起每2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大垂直徑，根據(jù)長×寬2×0.5計(jì)算腫瘤體積(Tumor Volume，TV)，比較各組治療后腫瘤體積。連續(xù)給藥結(jié)束后24小時，頸椎脫臼法處死裸鼠，將移植留完整切除，并稱其重量，比較各組治療后腫瘤重量。將剝除腫瘤置于10％的中性福爾馬林中固定24h，用梯度增高的酒精置換出組織內(nèi)水分，石蠟包埋，并切成4μm厚度的石蠟切片。石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素-伊紅染色，樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀

16、察移植瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 4)組織蛋白勻漿后，提取蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。Western blotting檢測空白組、DS組及DS/Cu組Nrf2及P65蛋白表達(dá)變化。
　　 8、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法;配對劑量資料的比較采用配對樣本t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較使用析因分析和單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在方差分析顯著的情況下使用Bonferron

17、i(方差齊性)進(jìn)行多重比較;若方差不齊則采用近似F檢驗(yàn)（如Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett T3方法進(jìn)行多重比較;計(jì)量資料用x±S表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、DS和DS/Cu對Raji細(xì)胞在體外具有明顯抑制增殖的作用:
　　 不同濃度的DS作用于Raji細(xì)胞72h后結(jié)果顯示細(xì)胞存活率均有不同程度的下降，且呈劑量依賴性，其IC50濃度為(0.793±0.08)μM。上述不

18、同濃度DS分別與濃度1μM Cu2+溶液聯(lián)合后對Raji細(xì)胞增殖抑制作用顯著增強(qiáng)，IC50濃度降為(0.085±0.015)μM。DS/Cu對Raji細(xì)胞的IC50顯著低于DS單藥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.110、P=0.000)，提示Cu可顯著增強(qiáng)DS對Raji細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　 2、DS和DS/Cu對Raji細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用:
　　 根據(jù)MTT和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取24小時IC50濃度的DS(DS:3.3

19、μM)及上述濃度的DS聯(lián)合Cu(Cu2+:1μM)分別作用Raji細(xì)胞6小時、12小時、24小時后觀察細(xì)胞凋亡比例變化。結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示，DS和DS/Cu分別作用于Raji細(xì)胞時間主效應(yīng)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.990，P=0.001)。隨作用時間延長，Raji細(xì)胞凋亡比例逐漸升高，凋亡比例表現(xiàn)時間依賴性，不同時間點(diǎn)DS及DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例均高于對照組(P＜0.05)。進(jìn)一步運(yùn)用單因素方差分析比較不同處理組細(xì)胞凋亡率的差異

20、，不同時間點(diǎn)DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，24小時DS組凋亡細(xì)胞比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，12小時和24小時DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例顯著高于DS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示DS和DS/Cu對Raji細(xì)胞均存在誘導(dǎo)凋亡的能力，但DS/Cu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯強(qiáng)于DS。
　　 3、DS和DS/Cu對腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響:

21、　　 選取24小時IC50濃度的DS(DS:3.3μM)及上述濃度的DS聯(lián)合Cu(Cu2+:1μM)分別作用Raji細(xì)胞6小時、12小時、24小時后觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示，DS和DS/Cu分別作用于Raji細(xì)胞時間主效應(yīng)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=10.252，P＜0.001)。隨作用時間延長，Raji細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高，并呈現(xiàn)時間依賴性，不同時間點(diǎn)的DS或者DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積的能力均高

22、于對照組(P＜0.05)。進(jìn)一步運(yùn)用單因素方差分析比較不同處理組ROS水平的差異，不同時間點(diǎn)DS和DS/Cu組ROS生成水平均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，12小時和24小時DS/Cu組ROS水平高于DS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明DS和DS/Cu均能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，但DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積的能力明顯強(qiáng)于DS單藥。
　　 4、Western blotting

23、檢測JNK通路蛋白及P65蛋白表達(dá)變化:
　　 共設(shè)立空白對照組、Cu單藥組、DS單藥組及DS/Cu聯(lián)合組，作用Raji細(xì)胞1小時后，western blotting結(jié)果顯示DS和DS/Cu處理組Raji細(xì)胞內(nèi)磷酸化.JNK(P-JNK)表達(dá)水平顯著增加，作用6小時后其下游分子C-jun表達(dá)水平較其他組顯著增加，其中DS/Cu組上調(diào)更明顯。同樣以western blotting檢測作用Raji細(xì)胞24小時候細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白表達(dá)

24、變化，DS和DS/Cu組P65蛋白表達(dá)均有下調(diào)，同樣DS/Cu組P65蛋白下調(diào)更加明顯。
　　 5、Western blotting檢測Nrf2蛋白表達(dá)變化:
　　 設(shè)立空白對照組、Cu單藥組、DS單藥組及DS/Cu聯(lián)合組，分別作用Raji細(xì)胞6小時、12小時及24小時后，western blotting結(jié)果顯示作用6小時和12小時后，DS及DS/Cu組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加;但當(dāng)作用時間延長至24

25、小時，DS及DS/Cu組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平較對照組反而顯著下降，且DS/Cu組Nrf2蛋白表達(dá)水平下調(diào)更加明顯。
　　 6、Western blotting檢測加入ROS抑制劑NAC后C-jun、P65及Nrf2蛋白表達(dá)變化:
　　 Western blotting結(jié)果顯示加入ROS抑制劑NAC后DS/Cu組對C-jun蛋白表達(dá)上調(diào)及P65及Nrf2蛋白表達(dá)下調(diào)的作用均可以被NAC不同程度的抑制。
　　

26、 7、成功建立Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤模型:
　　 移植成瘤率75％。中位成瘤時間6天(5-8天)，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)按計(jì)劃結(jié)束前無裸鼠死亡。
　　 8、DS和DS/Cu對Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生長的抑制作用:
　　 接種細(xì)胞后第6天、開始干預(yù)前移植瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，荷瘤鼠體重差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。灌胃用藥后，DS和DS/Cu組的

27、裸鼠移植瘤的體積和重量均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028和P=0.011;P=0.019和P=0.005)。DS/Cu組的瘤體體積和重量與DS組比較，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。移植瘤標(biāo)本經(jīng)HE染色后顯示，對照組腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)均較用藥組豐富，實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞出現(xiàn)核內(nèi)致密質(zhì)塊、核碎裂或核固縮，嗜酸性染色增強(qiáng)。提示這些細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)了凋亡的改變，DS/Cu組較明顯。
　　 9、Western blotti

28、ng檢測治療后裸鼠移植瘤組織中Nrf2及P65蛋白表達(dá)改變:移植瘤組織提取的蛋白質(zhì)經(jīng)Western blotting檢測結(jié)果顯示DS及DS/Cu組P65及Nrf2蛋白表達(dá)均下調(diào)，其中DS/Cu組下調(diào)更加顯著。
　　 結(jié)論:
　　 1、DS單藥對Raji細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，Cu可顯著增強(qiáng)DS抑制Raji細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。
　　 2、DS和DS/Cu均可促進(jìn)Raji細(xì)胞內(nèi)ROS生成，DS/Cu作

29、用更加顯著，且細(xì)胞內(nèi)ROS增加呈現(xiàn)時間依賴效應(yīng)。
　　 3、DS單藥和DS/Cu能夠增加Raji細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK(P-JNK)和c-jun蛋白表達(dá)水平，下調(diào)NF-κ B通路中P65蛋白表達(dá)水平，提示活化JNK/c-Jun通路及抑制NF-κ B通路是DS/Cu殺傷Raji細(xì)胞的重要機(jī)制之一。
　　 4、12小時內(nèi)隨著DS單藥和DS/Cu作用時間延長，細(xì)胞保護(hù)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達(dá)水平也增加，與細(xì)胞內(nèi)ROS增多成對應(yīng)關(guān)

30、系。但作用24小時后Nrf2蛋白表達(dá)水平反而下調(diào)，其中DS/Cu組下調(diào)更加顯著，而ROS水平繼續(xù)升高。提示ROS在細(xì)胞內(nèi)的大量蓄積超過閾值，能夠抑制Nrf2的活化，促進(jìn)DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。
　　 5、ROS抑制劑NAC能抑制DSF/Cu對C-jun、P65和Nrf2蛋白表達(dá)的影響，提示ROS與JNK、NF-κB和Nrf2通路之間的相互作用可能是DS/Cu誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。
　　 6、DS及