線蟲(chóng)脂肪酸代謝與性別決定研究.pdf

1、身體攝入能量過(guò)多而能量支出減少引起肥胖的出現(xiàn)，肥胖能觸發(fā)Ⅱ型糖尿病、心血管疾病等疾病的發(fā)生，給人類健康帶來(lái)重大隱患。引起人類肥胖的眾多因素中，基因起主導(dǎo)作用，因此研究肥胖的遺傳和生化機(jī)制已經(jīng)迫在眉睫。脂肪酸代謝通路中存在著一系列稱作脂酰輔酶A合成酶的基因ACSs(Acyl-CoA Synthetase)，它們催化自由脂肪酸與輔酶A形成脂酰輔酶A。所有自由脂肪酸都必須在ACSs作用下激活成脂酰輔酶A后方能進(jìn)入代謝途徑。此外ACSs的產(chǎn)物脂

2、酰輔酶A在胞內(nèi)還可直接與膜相互作用、為脂酰修飾蛋白提供底物、作為能量調(diào)節(jié)因子及參與膜泡運(yùn)輸?shù)取Ｒ虼搜芯緼CSs的功能對(duì)于理解肥胖的機(jī)制及信號(hào)通路的調(diào)控都有很大的幫助。本文利用線蟲(chóng)為模式生物研究脂酰輔酶A合成酶基因acs-4拘功能，重點(diǎn)分析了acs-4突變體絕育的表型、acs-4的功能及acs-4失活引起絕育的機(jī)制。
　　acs-4突變體有兩個(gè)獨(dú)立性狀:acs-4的失活導(dǎo)致雌雄同體的性腺被雄性化不能產(chǎn)生卵細(xì)胞，所有應(yīng)該分化成為卵細(xì)胞

3、的性腺細(xì)胞都分化成為精母細(xì)胞，這是性別決定問(wèn)題;此外acs-4失活還阻斷兩性個(gè)體中精母細(xì)胞向精子的分裂過(guò)程，從發(fā)育過(guò)程上來(lái)說(shuō)這個(gè)性狀出現(xiàn)于性別決定之后。本文主要研究了acs-4雌雄同體突變體的性腺雄性化表型。研究發(fā)現(xiàn)acs-4的表達(dá)位置非常廣泛，包括腸細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及性腺體細(xì)胞，但性腺雄性化的表型主要與acs-4在性腺中的失活有關(guān)。遺傳分析發(fā)現(xiàn)acs-4突變體的表型是性別決定信號(hào)通路的改變導(dǎo)致的?；騠og-1和fog-3的失活突變能抑

4、制acs-4突變體的性腺雄性化表型使之產(chǎn)生卵細(xì)胞。另fem-1，-2，-3的失活突變也能拯救acs-4突變體不能產(chǎn)生卵細(xì)胞的缺陷。此外tra-2(gf)突變體及能提高tra-2表達(dá)水平的突變體fog-2(lf)和ufd-2(RNAi)也能抑制acs-4突變體的性腺雄性化表型。因此遺傳上acs-4位于tra-2的上游。
　　ACS-4作為脂酰輔酶A合成酶，很可能通過(guò)影響脂類的代謝改變性腺的性別決定通路。但質(zhì)譜和氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)acs

5、-4突變體的脂類豐度和脂肪酸成分，與對(duì)照相比并沒(méi)有明顯的差別。為了找到作用于acs-4下游的基因，本研究對(duì)轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行RNAi篩選。篩選發(fā)現(xiàn)性腺中失活N-14碳脂?；D(zhuǎn)移酶基因nmt-1的功能引起雌雄同體的性腺被雄性化，這暗示ACS-4可能為NMT-1提供底物進(jìn)行蛋白質(zhì)的C14脂酰修飾。C14脂酰蛋白修飾另一必需基因map-2的失活也會(huì)導(dǎo)致雌雄同體的性腺被雄性化，這進(jìn)一步證明了C14脂酰蛋白修飾與性別決定相關(guān)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)acs-4和a

6、cs-17存在功能上的冗余，通過(guò)酵母基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ACS-4和ACS-17能激活C14和C16脂肪酸。這進(jìn)一步證明生化上ACS-4為NMT-1提供底物是可行的，而且這也證明了acs-4和acs-17在生化功能上的冗余。以上結(jié)果暗示:在野生型線蟲(chóng)N2中ACS-4為NMT-1提供底物進(jìn)行C14脂酰蛋白修飾，而在acs-4突變體中能被NMT-1利用的C14-CoA的水平過(guò)低導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的C14脂酰修飾不能進(jìn)行既而影響了性腺中的性別決定信

7、號(hào)通路。本文嘗試通過(guò)增加胞內(nèi)的C14-CoA的水平來(lái)拯救acs-4突變體的性腺雄性化表型。首先，外源注射C14-CoA到acs-4突變體的性腺能拯救acs-4突變體不能產(chǎn)生卵細(xì)胞的缺陷;其次，食物中添加外源脂肪酸也能在acs-4突變體中恢復(fù)卵細(xì)胞的產(chǎn)生，而且喂食外源脂肪酸恢復(fù)卵細(xì)胞依賴于acs-17的表達(dá);再次，通過(guò)prx-5(lf)和prx-6(lf)突變體失活過(guò)氧化物酶體提高胞內(nèi)C14-CoA的水平也能使acs-4突變體恢復(fù)卵細(xì)胞;

8、最后，RNAi失活C14-CoA延伸所需基因elo-1和elo-2也能部分拯救acs-4突變體不能產(chǎn)生卵細(xì)胞的缺陷。以上實(shí)驗(yàn)證明提高胞內(nèi)的C14-CoA水平能拯救acs-4突變體的性腺雄性化性狀，這也表明能被NMT-1利用的C14-CoA的水平過(guò)低導(dǎo)致了acs-4突變體的性腺雄性化性狀。免疫熒光實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)FEM-3蛋白在acs-4/HT2雜合體中能成簇(cluster)形成聚集的小點(diǎn)，但是在acs-4純合突變體中FEM-3擴(kuò)散不能成簇形

9、成小點(diǎn)。許多脂酰修飾蛋白質(zhì)都有成簇現(xiàn)象，這暗示FEM-3很可能被C14脂酰修飾。
　　根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本文提出模型認(rèn)為:在acs-4突變體中，acs-4的失活導(dǎo)致NMT-1沒(méi)有足夠的C14-CoA底物可用來(lái)修飾蛋白質(zhì)(很可能是FEM-3)，不被C14脂酰修飾的蛋白質(zhì)直接或間接的導(dǎo)致了FEM-3不能在膜上成簇，從而引起acs-4雌雄同體突變體的性腺被雄性化，不能產(chǎn)生卵細(xì)胞。本文首次發(fā)現(xiàn)了脂酰修飾影響性別決定信號(hào)通路，這是全新的性別