廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的克隆表達及其免疫學鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲病(Angiostrongyliasis cantonensis)為一種人獸共患病，其病原體為廣州管圓線蟲[Angiostrongylus cantonesis(chen，1935)Doughert,1946]。廣州管圓線蟲幼蟲在人體侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細胞增多性腦炎或腦膜炎。除大腦和腦膜外，病變還可波及小腦、腦干和脊髓。主要病理改變?yōu)槌溲⒊鲅?、腦組織損傷及肉芽腫性炎癥。病人最明顯的癥狀和體征為急性且止痛藥難以緩

2、解的劇烈頭痛和腦膜刺激征，還可伴有皮膚感覺異常，頸部運動疼痛、乏力，嚴重者可致昏迷甚至死亡。廣州管圓線蟲病主要流行于東南亞、南美及環(huán)太平洋國家和島嶼等地區(qū)。自從1944年臺灣首次報道廣州管圓線蟲病以來，我國大陸不斷出現(xiàn)新發(fā)病例的報道。在北京、浙江、云南等多個省份甚至出現(xiàn)了暴發(fā)流行。于2003年我國衛(wèi)生部將廣州管圓線蟲病其列為新發(fā)傳染病，說明該病在我國已引起高度重視。由于該病缺乏特異的臨床癥狀和體征，常被誤診為其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病而錯誤治療或

3、延誤治療而造成嚴重后果。因此廣州管圓線蟲病早期、準確的診斷在該病防治過程中起著非常重要的作用。
　　 本課題由：
　　 1.廣東省政府-國家自然科學聯(lián)合基金(u0632003)資助；
　　 2.973項目(2010CB530004)基金資助。
　　 臨床診斷主要依據(jù)患者有吞食或接觸含蟲的中間宿主或轉(zhuǎn)續(xù)宿主的經(jīng)歷及臨床癥狀，以患者腦脊液中查到蟲體為金標準，但此法檢出率低。目前實驗室最常采用ELISA法檢測病

4、人血清中的特異抗體。用于ELISA檢測的包被抗原通常為粗抗原，然而與其他寄生蟲有一定的交叉反應。近年來相繼有報道使用純化抗原作為ELISA包被抗原檢測病人血清和腦脊液中的抗體，在一定程度上降低了交叉反應。但獲得純化抗原不但費時費力而且要大量獲得較困難。因此，篩選出具有高敏感性和特異性的抗原組分，獲得其編碼基因，表達融合蛋白對廣州管圓線蟲病免疫診斷研究具有重要意義。生物信息學分析表明廣州管圓線蟲的組織蛋白酶-Z(Cathepsin-Z)包

5、含信號肽，且對其他寄生蟲組織蛋白酶-Z研究也提示該蛋白酶可能是分泌性的蛋白酶。作為分泌抗原，可能是廣州管圓線蟲病早期診斷的抗原候選分子。本實驗對廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因進行了克隆表達并對其在免疫診斷中的應用做了初步研究。
　　 目的：
　　 1.利用基因工程技術(shù)克隆廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因，運用生物信息學方法對其核苷酸及推導的氨基酸序列進行初步預測分析以了解蛋白質(zhì)的特性；
　　 2.構(gòu)建廣州管圓線蟲組

6、織蛋白酶-Z基因原核表達系統(tǒng)，優(yōu)化表達條件以獲得融合蛋白的高效表達。
　　 3.利用westen-blotting和ELISA分析對其免疫原性及抗原性進行初步研究，以對其血清學診斷價值做出客觀評價，為研制理想的廣州管圓線蟲病診斷試劑盒奠定基礎。
　　 方法：
　　 提取廣州管圓線蟲四期幼蟲的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒，根據(jù)說明書進行合成廣州管圓線蟲病四期幼蟲的總cDNA第一鏈。利用生物信息學對廣州管圓

7、線蟲組織蛋白酶-Z進行結(jié)構(gòu)及功能預測。去除信號肽的編碼序列，設計特異引物。PCR法體外擴增該基因，定向克隆至原核表達載體pET30a(+)構(gòu)建廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z原核表達體系，轉(zhuǎn)化入E.coli BL21以建立廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z重組融合蛋白的工程菌。IPTG誘導表達融合蛋白，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAG分析及Wstern-bloting鑒定。優(yōu)化表達條件使上述工程菌高效表達目的蛋白。親和層析法純化分離目的蛋白，純化蛋白免疫BA

8、LB/c小鼠研究其免疫原性及抗原性，Westen-blotting和ELISA法對分離純化融合蛋白進行免疫學鑒定和檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.獲得了廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的完整讀碼框，通過生物信息學分析，廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基岡與多個物種的組織蛋白酶-Z基因同源，其中與新隱桿線蟲的組織蛋白酶-Z的同源性最高，一致性為82％，相似性為89％。具有構(gòu)成真核生物半胱氨酸蛋白酶活性中心的三個氨基酸殘基。該蛋白具

9、有分泌型信號肽，未發(fā)現(xiàn)線粒體等亞細胞定位序列，沒有跨膜序列。
　　 2.成功克隆擴增了目的基岡。構(gòu)建的pET30a(+)-A.cantonesis-Cathepsin-Z重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定以及測序結(jié)果分析，表明成功構(gòu)建了廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的原核表達體系。
　　 3.將構(gòu)建的pET30a(+)-A.cantonesis-Cathepsin-Z重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，誘導表達后獲得

10、融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析與目的蛋白的理論分子量相符，Wstern-bloting分析融合蛋白可被抗His抗體識別。表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后得到純化的融合蛋白。
　　 4.免疫印跡及動物實驗證明融合蛋白具有免疫原性及抗原性。ELISA法檢測廣州管圓線蟲感染陽性小鼠血清、其它寄生蟲感染病人血清及正常人血清，結(jié)果顯示廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z融合蛋白對廣州管圓線蟲感染的檢測有較好的敏感性和特異性，其特異性優(yōu)于粗抗原，敏感性與粗