廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的克隆表達(dá)及其免疫學(xué)鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲病(Angiostrongyliasis cantonensis)為一種人獸共患病，其病原體為廣州管圓線蟲[Angiostrongylus cantonesis(chen，1935)Doughert,1946]。廣州管圓線蟲幼蟲在人體侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦炎或腦膜炎。除大腦和腦膜外，病變還可波及小腦、腦干和脊髓。主要病理改變?yōu)槌溲?、出血、腦組織損傷及肉芽腫性炎癥。病人最明顯的癥狀和體征為急性且止痛藥難以緩

2、解的劇烈頭痛和腦膜刺激征，還可伴有皮膚感覺異常，頸部運(yùn)動(dòng)疼痛、乏力，嚴(yán)重者可致昏迷甚至死亡。廣州管圓線蟲病主要流行于東南亞、南美及環(huán)太平洋國家和島嶼等地區(qū)。自從1944年臺(tái)灣首次報(bào)道廣州管圓線蟲病以來，我國大陸不斷出現(xiàn)新發(fā)病例的報(bào)道。在北京、浙江、云南等多個(gè)省份甚至出現(xiàn)了暴發(fā)流行。于2003年我國衛(wèi)生部將廣州管圓線蟲病其列為新發(fā)傳染病，說明該病在我國已引起高度重視。由于該病缺乏特異的臨床癥狀和體征，常被誤診為其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病而錯(cuò)誤治療或

3、延誤治療而造成嚴(yán)重后果。因此廣州管圓線蟲病早期、準(zhǔn)確的診斷在該病防治過程中起著非常重要的作用。
　　 本課題由：
　　 1.廣東省政府-國家自然科學(xué)聯(lián)合基金(u0632003)資助；
　　 2.973項(xiàng)目(2010CB530004)基金資助。
　　 臨床診斷主要依據(jù)患者有吞食或接觸含蟲的中間宿主或轉(zhuǎn)續(xù)宿主的經(jīng)歷及臨床癥狀，以患者腦脊液中查到蟲體為金標(biāo)準(zhǔn)，但此法檢出率低。目前實(shí)驗(yàn)室最常采用ELISA法檢測(cè)病

4、人血清中的特異抗體。用于ELISA檢測(cè)的包被抗原通常為粗抗原，然而與其他寄生蟲有一定的交叉反應(yīng)。近年來相繼有報(bào)道使用純化抗原作為ELISA包被抗原檢測(cè)病人血清和腦脊液中的抗體，在一定程度上降低了交叉反應(yīng)。但獲得純化抗原不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且要大量獲得較困難。因此，篩選出具有高敏感性和特異性的抗原組分，獲得其編碼基因，表達(dá)融合蛋白對(duì)廣州管圓線蟲病免疫診斷研究具有重要意義。生物信息學(xué)分析表明廣州管圓線蟲的組織蛋白酶-Z(Cathepsin-Z)包

5、含信號(hào)肽，且對(duì)其他寄生蟲組織蛋白酶-Z研究也提示該蛋白酶可能是分泌性的蛋白酶。作為分泌抗原，可能是廣州管圓線蟲病早期診斷的抗原候選分子。本實(shí)驗(yàn)對(duì)廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因進(jìn)行了克隆表達(dá)并對(duì)其在免疫診斷中的應(yīng)用做了初步研究。
　　 目的：
　　 1.利用基因工程技術(shù)克隆廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行初步預(yù)測(cè)分析以了解蛋白質(zhì)的特性；
　　 2.構(gòu)建廣州管圓線蟲組

6、織蛋白酶-Z基因原核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化表達(dá)條件以獲得融合蛋白的高效表達(dá)。
　　 3.利用westen-blotting和ELISA分析對(duì)其免疫原性及抗原性進(jìn)行初步研究，以對(duì)其血清學(xué)診斷價(jià)值做出客觀評(píng)價(jià)，為研制理想的廣州管圓線蟲病診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 提取廣州管圓線蟲四期幼蟲的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行合成廣州管圓線蟲病四期幼蟲的總cDNA第一鏈。利用生物信息學(xué)對(duì)廣州管圓

7、線蟲組織蛋白酶-Z進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)。去除信號(hào)肽的編碼序列，設(shè)計(jì)特異引物。PCR法體外擴(kuò)增該基因，定向克隆至原核表達(dá)載體pET30a(+)構(gòu)建廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z原核表達(dá)體系，轉(zhuǎn)化入E.coli BL21以建立廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z重組融合蛋白的工程菌。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAG分析及Wstern-bloting鑒定。優(yōu)化表達(dá)條件使上述工程菌高效表達(dá)目的蛋白。親和層析法純化分離目的蛋白，純化蛋白免疫BA

8、LB/c小鼠研究其免疫原性及抗原性，Westen-blotting和ELISA法對(duì)分離純化融合蛋白進(jìn)行免疫學(xué)鑒定和檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.獲得了廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的完整讀碼框，通過生物信息學(xué)分析，廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基岡與多個(gè)物種的組織蛋白酶-Z基因同源，其中與新隱桿線蟲的組織蛋白酶-Z的同源性最高，一致性為82％，相似性為89％。具有構(gòu)成真核生物半胱氨酸蛋白酶活性中心的三個(gè)氨基酸殘基。該蛋白具

9、有分泌型信號(hào)肽，未發(fā)現(xiàn)線粒體等亞細(xì)胞定位序列，沒有跨膜序列。
　　 2.成功克隆擴(kuò)增了目的基岡。構(gòu)建的pET30a(+)-A.cantonesis-Cathepsin-Z重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定以及測(cè)序結(jié)果分析，表明成功構(gòu)建了廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z基因的原核表達(dá)體系。
　　 3.將構(gòu)建的pET30a(+)-A.cantonesis-Cathepsin-Z重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入E.coli BL21，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得

10、融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析與目的蛋白的理論分子量相符，Wstern-bloting分析融合蛋白可被抗His抗體識(shí)別。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后得到純化的融合蛋白。
　　 4.免疫印跡及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白具有免疫原性及抗原性。ELISA法檢測(cè)廣州管圓線蟲感染陽性小鼠血清、其它寄生蟲感染病人血清及正常人血清，結(jié)果顯示廣州管圓線蟲組織蛋白酶-Z融合蛋白對(duì)廣州管圓線蟲感染的檢測(cè)有較好的敏感性和特異性，其特異性優(yōu)于粗抗原，敏感性與粗