結核分枝桿菌mazEF基因及結核病生物標志物的探究.pdf

1、目的：
　　(1)構建北京、非北京基因型結核分枝桿菌、標準株（H37RV)的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的過表達菌株，觀測其在低氧、營養(yǎng)缺乏條件下的生存能力，同時檢測不同電轉(zhuǎn)電壓下過表達菌株相應基因的mRNA表達水平。
　　(2)檢測預測的7種細胞因子的mRNA的表達水平，探討目的因子分子表達水平作為結核分枝桿菌潛伏感染診斷的生物標志物的可能性。
　　方法：
　　(1)利用大腸桿菌-結核分枝桿菌穿

2、梭表達質(zhì)粒pMV361，構建出重組質(zhì)粒pMV361-mazEF3、pMV361-mazEF6、pMV361-mazEF9；電穿孔將重組質(zhì)粒導入北京基因型、非北京基因型結核分枝桿菌中。在卡那霉素培養(yǎng)基上初步篩選，提取陽性菌株的質(zhì)粒進行PCR、雙酶切，送公司測序，驗證構建是否成功；檢測不同菌株在不同生長條件下的生長情況。實時熒光定量PCR技術檢測不同電轉(zhuǎn)電壓下mazEF3的mRNA表達水平，尋找構建mazEF3過表達菌株的最佳電轉(zhuǎn)電壓。

3、r>　　(2)健康對照組64人，活動性肺結核50人，結核分枝桿菌潛伏感染60人，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測結核特異性抗原刺激的外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IFI35、IP10及Foxp3的mRNA表達水平。
　　結果：
　　(1)成功構建了H37RV、北京、非北京基因型的結核分枝桿菌的mazEF3、mazEF6、mazEF9過表達菌株。北京基因型的結核分枝桿菌在正常和應激環(huán)境下，生長狀

4、態(tài)均好于非北京基因型結核分枝桿菌。實時熒光定量檢測，電轉(zhuǎn)電壓為2300V時，構建的過表達菌株mazEF3的mRNA表達量最高。
　　(2)7種因子相對表達量在活動性肺結核組為2.33±0.09、4.94±0.45、150±17.82、2.02±0.55、9.53±5.96、5.56±0.97、1.24±0.17，潛伏感染組分別為3.2±0.61、10.04±1.89、202±17.6、21.89±10.25、29.17±11.19

5、、41.35±11.46、2.14±0.67，健康組分別為1.2±0.08、2.92±0.03、53±17.82、1.48±0.17、1.28±0.77、1.63±0.25、1.03±0.67。潛伏感染組與健康組相比7種細胞因子的mRNA表達水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），相應細胞因子檢測的敏感性、特異性分別為95.1％、82.5%，92.5%、88.7%，91.9%、90.1%，88.2%、51.5%，74.2%、61.2%

6、，81.8%、73.4%和80.4%、51.3%；潛伏感染組和活動性結核組比較除IFI35因子外，其余6種細胞因子的mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），相應細胞因子檢測的特異性、敏感性分別為90.6%、80%，88.6%、92.7%，91.9%、86.2%，57.6%、60%，50%、58%，76%、72.2%和66.7%、67.1%；健康對照組和活動性結核組相比較，7種細胞因子的mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P<

7、0.01），相應細胞因子檢測的敏感性、特異性分別為92.3%、90%，88.6%、86.7%，94.4%、86.7%，89.7%、65.8%，82.4%、63.3%，88.2%、70%和92.9%、72.1%。結核病密切接觸者潛伏感染率為48.97%，健康組潛伏感染率為36%。
　　結論：
　　(1)成功構建了北京、非北京基因型的mazEF3、mazEF6、mazEF9過表達菌株，2300V是mazEF3的最佳電轉(zhuǎn)電壓。