結(jié)核分枝桿菌mazEF基因及結(jié)核病生物標(biāo)志物的探究.pdf

1、目的：
　　(1)構(gòu)建北京、非北京基因型結(jié)核分枝桿菌、標(biāo)準(zhǔn)株（H37RV)的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的過(guò)表達(dá)菌株，觀測(cè)其在低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下的生存能力，同時(shí)檢測(cè)不同電轉(zhuǎn)電壓下過(guò)表達(dá)菌株相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平。
　　(2)檢測(cè)預(yù)測(cè)的7種細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)水平，探討目的因子分子表達(dá)水平作為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染診斷的生物標(biāo)志物的可能性。
　　方法：
　　(1)利用大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿

2、梭表達(dá)質(zhì)粒pMV361，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMV361-mazEF3、pMV361-mazEF6、pMV361-mazEF9；電穿孔將重組質(zhì)粒導(dǎo)入北京基因型、非北京基因型結(jié)核分枝桿菌中。在卡那霉素培養(yǎng)基上初步篩選，提取陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切，送公司測(cè)序，驗(yàn)證構(gòu)建是否成功；檢測(cè)不同菌株在不同生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同電轉(zhuǎn)電壓下mazEF3的mRNA表達(dá)水平，尋找構(gòu)建mazEF3過(guò)表達(dá)菌株的最佳電轉(zhuǎn)電壓。

3、r>　　(2)健康對(duì)照組64人，活動(dòng)性肺結(jié)核50人，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染60人，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)核特異性抗原刺激的外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IFI35、IP10及Foxp3的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建了H37RV、北京、非北京基因型的結(jié)核分枝桿菌的mazEF3、mazEF6、mazEF9過(guò)表達(dá)菌株。北京基因型的結(jié)核分枝桿菌在正常和應(yīng)激環(huán)境下，生長(zhǎng)狀

4、態(tài)均好于非北京基因型結(jié)核分枝桿菌。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，電轉(zhuǎn)電壓為2300V時(shí)，構(gòu)建的過(guò)表達(dá)菌株mazEF3的mRNA表達(dá)量最高。
　　(2)7種因子相對(duì)表達(dá)量在活動(dòng)性肺結(jié)核組為2.33±0.09、4.94±0.45、150±17.82、2.02±0.55、9.53±5.96、5.56±0.97、1.24±0.17，潛伏感染組分別為3.2±0.61、10.04±1.89、202±17.6、21.89±10.25、29.17±11.19

5、、41.35±11.46、2.14±0.67，健康組分別為1.2±0.08、2.92±0.03、53±17.82、1.48±0.17、1.28±0.77、1.63±0.25、1.03±0.67。潛伏感染組與健康組相比7種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），相應(yīng)細(xì)胞因子檢測(cè)的敏感性、特異性分別為95.1％、82.5%，92.5%、88.7%，91.9%、90.1%，88.2%、51.5%，74.2%、61.2%

6、，81.8%、73.4%和80.4%、51.3%；潛伏感染組和活動(dòng)性結(jié)核組比較除IFI35因子外，其余6種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），相應(yīng)細(xì)胞因子檢測(cè)的特異性、敏感性分別為90.6%、80%，88.6%、92.7%，91.9%、86.2%，57.6%、60%，50%、58%，76%、72.2%和66.7%、67.1%；健康對(duì)照組和活動(dòng)性結(jié)核組相比較，7種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

7、0.01），相應(yīng)細(xì)胞因子檢測(cè)的敏感性、特異性分別為92.3%、90%，88.6%、86.7%，94.4%、86.7%，89.7%、65.8%，82.4%、63.3%，88.2%、70%和92.9%、72.1%。結(jié)核病密切接觸者潛伏感染率為48.97%，健康組潛伏感染率為36%。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建了北京、非北京基因型的mazEF3、mazEF6、mazEF9過(guò)表達(dá)菌株，2300V是mazEF3的最佳電轉(zhuǎn)電壓。