結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6-PPE68融合蛋白的表達(dá)及其在結(jié)核病診斷中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。通過(guò)親和層析法分離、純化所表達(dá)的目的蛋白，將其作為一種特異性抗原，間接ELISA法檢測(cè)臨床已確診為結(jié)核?。òǚ谓Y(jié)核和肺外結(jié)核）病人的血清，統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和敏感性，為其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.以結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的DNA作為模板，PCR法擴(kuò)增E

2、SAT6和PPE68基因，利用基因拼接技術(shù)中的Gene-SOEing法擴(kuò)增ESAT6-PPE68融合基因，克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分別以H37Rv株DNA和重組質(zhì)粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68為模板擴(kuò)增CFP10和ESAT6-PPE68基因，Gene-SOEing法獲取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68，克隆至pET-32a(+)載

3、體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68，并用酶切和測(cè)序鑒定。
　　 2.將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)其大量表達(dá)，用Western blot鑒定重組蛋白。用親和層析法分離、純化所表達(dá)的融合蛋白。
　　 3.將純化的融合蛋白作為一種特異性抗原，間接ELISA法檢測(cè)已臨床確診為結(jié)核病（包括250例

4、肺結(jié)核和66例肺外結(jié)核）病人血清，58例正常人血清，統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和敏感性。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68經(jīng)內(nèi)切酶作用后在1782 bp處可見CFP10-ESAT6-PPE68目的基因片段，片段大小與預(yù)期一致。基因測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的堿基序列與理論值相符。
　　 2.成功誘導(dǎo)表達(dá)CFP10-ESAT6-PPE68融合蛋白，SDS-PA

5、GE分析誘導(dǎo)產(chǎn)物的相對(duì)分子量約為77 KDa，包括相對(duì)分子量約20 KDa的Trx條帶;相對(duì)分子量約為11 KDa的CFP10;相對(duì)分子量約9 KDa的ESAT6;相對(duì)分子量約為37 KDa的PPE68。Western blot分析誘導(dǎo)表達(dá)蛋白可與結(jié)核分枝桿菌感染BALB/c小鼠的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對(duì)分子量約77 KDa處可見明顯條帶。融合蛋白用親和層析法分離、純化后，Bandscan軟件分析目的蛋白的純度約為87.3％。

6、　　 3.將純化后CFP10-ESAT6-PPE68融合蛋白作為特異性診斷抗原，以臨床確診結(jié)核病人作為金標(biāo)準(zhǔn)，58例正常人血清作為陰性對(duì)照，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明融合蛋白檢測(cè)肺結(jié)核病人和肺外結(jié)核病人的特異性分別為94.8％和98.3％;準(zhǔn)確性分別為63.6％和93.5％;敏感性分別為56.4％和89.3％。
　　 結(jié)論:
　　 1.將CFP10、ESAT6和PPE68三種特異性基因成功融合并插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+