磷酸酶-張力蛋白同源物-PTEN與心肌細(xì)胞鈣-心肌肥厚關(guān)系的研究.pdf

1、1.背景與目的： 研究證實(shí)，心肌肥厚是多種心血管病的共同病理結(jié)局，也是導(dǎo)致心力衰竭的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其主要特征是細(xì)胞體積增大、蛋白合成增加、胚胎型基因表達(dá)上調(diào)。早期的心肌肥厚可能是心肌細(xì)胞對內(nèi)外界刺激的一種適應(yīng)性改變，有一定的代償意義，但持續(xù)的心肌肥厚最終會不可避免地導(dǎo)致心力衰竭，甚至猝死。由心肌肥大發(fā)展到心力衰竭，再由心力衰竭導(dǎo)致死亡，是臨床心血管病人主要死亡的病理過程，臨床研究表明逆轉(zhuǎn)心肌肥厚能明顯改善患者的預(yù)后。 心

2、肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+]i)的變化在心肌肥厚中起了重要作用，是不同心肌肥厚信號通路的共同匯集點(diǎn)。研究表明，心肌細(xì)胞[Ca2+]i主要受心肌細(xì)胞外Ca2+和心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的兩方面調(diào)節(jié)。心肌細(xì)胞膜外的Ca2+跨膜內(nèi)流，如電壓依賴性Ca2+通道和受體依賴性Ca2+通道；心肌細(xì)胞胞漿Ca2+貯存池釋放，主要為分布在肌漿網(wǎng)(SR)的ryanodine敏感受體(RyR2)和IP3敏感受體(IP3R)，能分別被ryanodine和IP3激

3、動，釋放內(nèi)貯Ca2+，釋放內(nèi)貯Ca2+進(jìn)入胞漿。 既往關(guān)于心肌肥厚的研究主要集中在促心肌肥厚方面，即引起心肌肥厚的各種刺激是通過什么信號通路導(dǎo)致心肌肥厚，以及這些信號通路之間又是如何相互影響的。傳統(tǒng)的藥物，如ACEI、β-腎上腺素能阻滯劑等，雖能減輕心肌肥厚，但不能完全逆轉(zhuǎn)?；诖朔N考慮，積極探索如何有效阻止心肌肥厚的機(jī)制就十分必要。我們提出一種假設(shè)，認(rèn)為在心肌肥厚的過程中存在負(fù)性調(diào)控，即在促肥厚刺激的作用下，內(nèi)源性抑制心肌肥厚

4、因子被釋放，以拮抗促肥厚刺激的促心肌肥厚作用，使得促肥厚/抗肥厚二者在一定階段內(nèi)維持平衡，阻止心肌肥厚的進(jìn)一步加劇。促肥厚、抗肥厚二者之間是否平衡決定心肌肥厚的最終結(jié)局，當(dāng)促肥厚占優(yōu)勢，心肌肥厚則進(jìn)一步加劇，當(dāng)抗肥厚占優(yōu)勢，則心肌肥厚被減輕或逆轉(zhuǎn)。 磷酸酶-張力蛋白同源物—PTEN(PhosphataseandTensinHomologyDeletedonChromosomeTen)是1997年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，定位于人染色體

5、10q23.3，全長200kb，有9個外顯子和8個內(nèi)含子。PTEN蛋白雖然沒有SH2結(jié)構(gòu)和跨膜信號，但其具有雙特異性磷酸酶活性，即蛋白磷酸酶和脂性磷酸酶。PTEN的脂性磷酸酶通過PTEN/PI3K/PKB途徑，使磷脂酰肌醇酯三磷酸(PIP3)去磷酸化，將PIP3轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，逆轉(zhuǎn)了PI3K對PKB磷酸化作用，從而抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PTEN的蛋白磷酸酶活性能能使磷酸化的酪氨酸殘基、絲氨酸/蘇氨酸殘基去磷酸化，對細(xì)胞周期、細(xì)胞黏

6、附等起負(fù)性調(diào)控作用。Schwartzbauer等將野生型PTEN轉(zhuǎn)染給原代新生小鼠的心肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡增加，caspase-3活性增強(qiáng)；而將突變型PTEN-H123Y轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后，卻導(dǎo)致心肌肥厚(表現(xiàn)為心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、細(xì)胞表面積增大、ANF表達(dá)上調(diào))，caspase-3活性不受影響。Michael等敲除小鼠的PTEN基因，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟外觀明顯增大，PTEN基因缺乏導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥厚有其獨(dú)特的特點(diǎn)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的長度

7、、寬度均明顯增加，但其長度、寬度之比卻改變不明顯；且其ANF、α-MHC、BNP等基因表達(dá)均無明顯改變，僅有β-MHC表達(dá)增加，這和病理性心肌肥厚不同。說明PTEN基因缺乏導(dǎo)致的心肌肥厚類似與生理性心肌肥厚。 上述學(xué)者的研究均證明PTEN具有抑制心肌肥厚的作用。但是，目前還不明確心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+如何影響PTEN；具有抑制心肌肥厚作用的PTEN在心肌肥厚中表達(dá)如何；ACEI類藥物(如卡托普利)干預(yù)對其表達(dá)又有何影響。 本

8、研究以培養(yǎng)的心肌細(xì)胞、心肌肥厚動物模型為研究平臺，分別從細(xì)胞、組織水平去探討上述問題：①以AngⅡ刺激心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，觀察心肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流對PTEN的影響；②以RY刺激心肌細(xì)胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放，觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放對PTEN的影響；同時分別用硝苯地平阻斷心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、釕紅阻斷心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放、LY294002抑制PI3K酶活性，觀察其對PTEN表達(dá)的影響；③建立心肌肥厚的動物模型，觀察肥厚心肌組織的PTEN表

9、達(dá)變化及卡托普利對其表達(dá)影響，初步闡明PTEN與心肌肥厚的關(guān)系。 2.方法 本研究分為3部分，第一部分用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞，探討心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流對PTENmRNA和蛋白表達(dá)影響，同時測定心肌細(xì)胞3H-Leu摻入率以反映心肌細(xì)胞蛋白合成、心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流與PTEN蛋白的亞細(xì)胞定位關(guān)系，同時還觀察硝苯地平阻斷AngⅡ介導(dǎo)心肌細(xì)胞外內(nèi)流對PTEN表達(dá)影響、LY294002抑制PI3K酶活性后心肌細(xì)胞外內(nèi)流對PTE

10、N表達(dá)影響。第二部分用RY刺激心肌細(xì)胞，探討心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放對PTENmRNA和蛋白表達(dá)影響，同時測定心肌細(xì)胞3H-Leu摻入率，同時還觀察釕紅阻斷RY介導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放對PTEN表達(dá)影響、LY294002抑制PI3K酶活性后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放對PTEN表達(dá)影響。第三部分是建立心肌肥厚動物模型，測定血液動力學(xué)指標(biāo)、心肌肥厚指標(biāo)，電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)，測定肥厚程度不同的心肌組織的PTENmRNA和蚩白表達(dá)及卡托普利干預(yù)對肥

11、厚心肌PTEN表達(dá)影響。 3.結(jié)果 (1)AngⅡ能濃度依賴性(10-8mol/L～10-5mol/L)、時間依賴性增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、心肌細(xì)胞3H-Leu摻入率。 (2)在10-8mol/L～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著AngⅡ介導(dǎo)心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的增加，心肌細(xì)胞PTENmRNA和蛋白表達(dá)均升高。 (3)用10-7mol/L的AngⅡ刺激心肌細(xì)胞，隨著其刺激時間的延長，心肌細(xì)胞PTE

12、NmRNA和蛋白表達(dá)均升高。 (4)用10-7mol/L的AngⅡ刺激心肌細(xì)胞24h、48h，PTEN蛋白的亞細(xì)胞定位主要在心肌細(xì)胞胞漿，而胞核中沒有PTEN蛋白表達(dá)。 (5)Nif在10-8mol/L～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，能濃度依賴性抑制AngⅡ介導(dǎo)胞外鈣內(nèi)流的促PTENmRNA、蚩白表達(dá)作用。 (6)不同濃度的LY294002(10-7mol/L～10-5mol/L)阻斷PI3K酶活性后，心肌細(xì)胞外

13、Ca2+內(nèi)流的促PTEN表達(dá)作用明顯減弱。 (7)RY能濃度依賴性(10-8mol/L～10-6mol/L)、時間依賴性增加心肌細(xì)胞[Ca2+]i、心肌細(xì)胞3H-Leu摻入率(RY在10-5mol/L時，心肌細(xì)胞[Ca2+]i和3H-Leu摻入率反而下降)。 (8)在10-8mol/L～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著RY介導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的增加，心肌細(xì)胞PTENmRNA和蚩白表達(dá)均升高(RY在10-5mol/

14、L時，心肌細(xì)胞PTENmRNA和蛋白卻下降)。 (9)用10-7mol/L的RY刺激心肌細(xì)胞，隨著其刺激時間的延長，心肌細(xì)胞PTENmRNA和蚩白表達(dá)均升高。 (10)用10-7mol/L的RY刺激心肌細(xì)胞24h、48h，PTEN蛋白的亞細(xì)胞定位主要在心肌細(xì)胞胞漿，而胞核中沒有PTEN蛋白表達(dá)。 (11)釕紅在10-8mol/L～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，能濃度依賴性地抑制RY介導(dǎo)胞內(nèi)鈣釋放的促PTENmRN

15、A、蛋白表達(dá)作用。 (12)不同濃度的LY294002(10-7mol/L～10-5mol/L)阻斷PI3K酶活性后，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的促PTEN表達(dá)作用明顯減弱。 (13)持續(xù)皮下小劑量注射異丙腎上腺素能成功建立心肌肥厚動物模型，隨著心肌肥厚程度的加重，PTENmRNA和蛋白表達(dá)均升高。 (14)卡托普利逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、改善血液動力學(xué)參數(shù)的同時，能上調(diào)心肌組織PTEN的表達(dá)。 4.結(jié)論 (1

16、)心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流能促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白合成，增加PTENmRNA和蛋白表達(dá)。 (2)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放能促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白合成，增加PTENmRNA和蛋白表達(dá)。 (3)PI3K酶活性與心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放對PTEN的促表達(dá)有關(guān)。 (4)小劑量持續(xù)給予ISO能建立心肌肥厚動物模型，隨著心肌肥厚程度的加重，心肌組織PTENmRNA和蛋白表達(dá)均逐漸增加。 (5)卡托普利在改善血液