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1、 學(xué) 校 代 碼 學(xué) 校 代 碼 : 1 0 2 6 4 1 0 2 6 4 研究生學(xué)號(hào): M1110104176上 海 海 洋 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 碩 士 學(xué) 位 論 文 題 目: 目: 血藍(lán)蛋白在雜色鮑各組織中的表達(dá)與分布規(guī) 血藍(lán)蛋白在雜色鮑各組織中的表達(dá)與分布規(guī)律研究 律研究 英文題目: 英文題目: Studies on the expressing and distributing charact
2、eristic of Hemocyanin in different tissues of Haliotis diversicolor 專 業(yè): 業(yè): 臨床獸醫(yī)學(xué) 研究方向: 研究方向: 漁業(yè)生物病害 姓 名: 名: 張晗 指導(dǎo)教師: 指導(dǎo)教師: 王江勇 研究員 上海海洋大學(xué),上海,200090 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)研究所,廣州 ,510300 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 I 血藍(lán)蛋白在雜色鮑各組織中的表達(dá)與分布規(guī)律
3、研究 摘 要 血藍(lán)蛋白(hemocyanin)是節(jié)肢、軟體動(dòng)物中的一種多功能蛋白,具有氧氣運(yùn)輸、免疫防御、蛋白質(zhì)儲(chǔ)存、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛻皮激素載體、滲透壓調(diào)節(jié)和表皮固化等多種功能。 血藍(lán)蛋白在血淋巴中的含量非常豐富, 然而作為一種重要的多功能蛋白, 對(duì)其成熟的蛋白分子在動(dòng)物各組織中的分布情況了解較少, 其組織表達(dá)的具體部位尚不明確。 本研究通過免疫組化技術(shù)、 熒光定量 PCR 技術(shù) (qPCR)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)對(duì)血藍(lán)蛋白在
4、雜色鮑(Haliotis diversicolor)各組織中的表達(dá)與分布規(guī)律進(jìn)行了研究, 對(duì)深入理解血藍(lán)蛋白分子功能的多樣性及軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白組織表達(dá)規(guī)律的生理適應(yīng)性具有重要意義。 首先通過 Western Blotting 方法對(duì)雜色鮑血藍(lán)蛋白多克隆抗體的濃度進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)上樣量 10 μg 時(shí),一抗 1:12000 的稀釋度所見清晰條帶最多;在一抗1:12000 的稀釋度時(shí),不同上樣量(1 μg、2 μg、4 μg 和 8 μg)
5、Western 結(jié)果的雜交條帶都比較清晰,故 1:12000 的抗體稀釋度最適合本研究。進(jìn)一步的免疫組化研究發(fā)現(xiàn), 在成鮑和幼鮑各組織中均發(fā)現(xiàn)了血藍(lán)蛋白陽性信號(hào), 但不同組織中信號(hào)強(qiáng)弱不同,在成鮑與幼鮑中血藍(lán)蛋白的組織分布一致,均為肝胰臟、外套膜和鰓中大量分布,而消化道和腹足中的分布相對(duì)較少。 其次,采用 qPCR 技術(shù)對(duì)編碼血藍(lán)蛋白的兩個(gè)亞型基因(Hc1、Hc2)在各組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。 首先, 根據(jù)課題組克隆得到的雜色鮑血藍(lán)
6、蛋白全基因序列對(duì)兩個(gè)基因分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物,利用腹足、鰓和鰓下腺組織的cDNA 作為模板,對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)引物 Hc1F2/Hc1R2 和Hc2F1/Hc2R1 的特異性良好。qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明,Hc1 與 Hc2 在成鮑腹足、外套膜、上足、鰓下腺、鰓、肝胰臟和血細(xì)胞中均有表達(dá),并且兩基因的組織表達(dá)豐度一致,均在肝胰臟、外套膜、鰓下腺和鰓中較高,而血細(xì)胞、腹足和上足中較低。兩個(gè)基因相比較發(fā)現(xiàn),各組織中 Hc1 表達(dá)量
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