雜色鮑在不同外界因子脅迫下HIF信號(hào)通路相關(guān)基因的研究.pdf

1、近些年，全球氣候的變暖已經(jīng)對(duì)自然和社會(huì)環(huán)境產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，水溫的升高可能會(huì)導(dǎo)致一系列的負(fù)面影響，如微生物的大量繁殖和溶解氧的降低。這些環(huán)境因素的改變最終將導(dǎo)致水生生物暴露于缺氧的環(huán)境中。一般情況下，外界環(huán)境的改變往往會(huì)誘發(fā)機(jī)體內(nèi)一系列的生理生化的變化來適應(yīng)這一改變。而這一適應(yīng)的過程，在很大程度上都依賴于編碼這些理化反應(yīng)相關(guān)蛋白基因的表達(dá)水平的改變。缺氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor1，H

2、IF-1）包括α和β兩個(gè)亞基，是缺氧環(huán)境下的一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過對(duì)不同基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)來適應(yīng)缺氧的環(huán)境。本研究首次對(duì)雜色鮑（Haliotis diversicolor）的HIF-1α、HIF-1β和硒結(jié)合蛋白1（Selenium-binding protein1， SBP1）基因進(jìn)行了報(bào)道，并分別將雜色鮑的HIF-1α、HIF-1β和SBP1基因命名為HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1。同時(shí)，采用生物信息學(xué)的方法

3、分析了雜色鮑的HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1基因的特征。另外，我們還利用實(shí)時(shí)定量PCR和RNA干擾等技術(shù)分析了HIF信號(hào)通路相關(guān)基因在雜色鮑缺氧、高溫、缺氧&高溫聯(lián)合應(yīng)激以及副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。主要的研究結(jié)果如下：
　?。?）獲得了雜色鮑HdHIF-1α、HdHIF-1β和HdSBP1的全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)度分別為2833 bp、1919 bp和

4、2269 bp并分別編碼了711個(gè)氨基酸、590個(gè)氨基酸和497個(gè)氨基酸。與其它物種的 HIF-1相似，雜色鮑 HdHIF-1也具有一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）和兩個(gè) PAS（PERARNT-SIM）結(jié)構(gòu)域。其中 HdHIF-1α還有一個(gè)氧依賴的降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（C-terminal ac

5、tivation domain, C-TAD)。同時(shí)，我們還使用生物信息學(xué)方法對(duì)HIF-1α、HIF-1β和SBP1基因進(jìn)行了基因同線性分析。
　?。?）在鰓組織中，HdHIF-1α基因在雜色鮑經(jīng)不同外界因子脅迫下各時(shí)相的qRT-PCR結(jié)果顯示：缺氧處理之后，HdHIF-1α的表達(dá)量在處理4 h、24 h和96 h后實(shí)驗(yàn)組顯著性高于對(duì)照組（P<0.05）；高溫應(yīng)激之后，實(shí)驗(yàn)組HdHIF-1α基因的表達(dá)量在第三時(shí)相（31℃4 h）顯

6、著性高于對(duì)照組（P<0.05）。缺氧&高溫聯(lián)合應(yīng)激之后，HdHIF-1α的表達(dá)量在0 h、4 h和24 h實(shí)驗(yàn)組顯著性高于對(duì)照組（P<0.05）；副溶血弧菌注射感染之后，3 h和12 h實(shí)驗(yàn)組顯著性高于對(duì)照組（ P<0.05）。在血細(xì)胞中， HdHIF-1α基因在雜色鮑缺氧應(yīng)激后， HdHIF-1α的表達(dá)量在處理24 h和96 h后的實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；高溫應(yīng)激后， HdHIF-1α的表達(dá)量在第2和3時(shí)相實(shí)驗(yàn)組顯著高于

7、對(duì)照組（P<0.05）；缺氧&高溫聯(lián)合應(yīng)激后，HdHIF-1α的表達(dá)量在24 h和96 h實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；副溶血弧菌注射感染之后，HdHIF-1α基因的表達(dá)量在每個(gè)時(shí)相的實(shí)驗(yàn)組都顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　（3）HdHIF-1β基因在雜色鮑鰓組織和血細(xì)胞中，每個(gè)應(yīng)激之后各時(shí)相的qRT-PCR結(jié)果顯示：HdHIF-1β的表達(dá)量在處理組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)量無顯著差異。
　?。?）HdSBP1基因

8、在雜色鮑經(jīng)不同外界因子脅迫下各時(shí)相的 qRT-PCR結(jié)果顯示：缺氧處理之后，實(shí)驗(yàn)組HdSBP1在鰓組織和血細(xì)胞的表達(dá)量分別在處理24 h和192 h后顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；高溫應(yīng)激之后，在鰓組織中，實(shí)驗(yàn)組HdSBP1的表達(dá)量在第1時(shí)相（28℃）與第3時(shí)相（31℃4 h）顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而在血細(xì)胞中只有在第3時(shí)相實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異；缺氧&高溫聯(lián)合應(yīng)激之后，在鰓組織中 HdSBP1的表達(dá)量在192 h實(shí)驗(yàn)

9、組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在血細(xì)胞中HdSBP1的表達(dá)量在0 h、4 h和24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；副溶血弧菌注射感染之后，在鰓組織中HdSBP1的表達(dá)量在6 h和24 h實(shí)驗(yàn)組顯著性高于對(duì)照組（P<0.05），而血細(xì)胞中HdSBP1基因的表達(dá)量在每個(gè)時(shí)相的實(shí)驗(yàn)組都顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　（5）在不同刺激處理下的雜色鮑鰓組織和血細(xì)胞中，一氧化氮合酶（Nitric oxide syntha

10、se，HdNOS）與腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factorα, HdTNF-α）基因在各時(shí)相的表達(dá)都有不同程度上的顯著變化（P<0.05）。
　?。?）RNA干擾抑制HdHIF-1α后，培養(yǎng)的血細(xì)胞中HdHIF-1α基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05）。同時(shí)，也檢測(cè)了 HdHIF-1α受抑制后，HdHIF-1α若干靶基因的表達(dá)情況，如：HdTNFα、細(xì)胞凋亡蛋白酶（Caspase3，HdCasp3）、乳糖脫氫酶