釘螺血藍(lán)蛋白功能域的克隆與重組表達(dá)研究.pdf

1、　　血吸蟲(chóng)病是一種人、畜共患的寄生蟲(chóng)病,我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)。在日本血吸蟲(chóng)生活史中,釘螺(Oncomelania hupensis)是其唯一的中間宿主,日本血吸蟲(chóng)病的地理分布與釘螺的分布相吻合,因此控制釘螺的繁衍與傳播是減少血吸蟲(chóng)病傳播的有效手段。目前,化學(xué)滅螺是最常用的滅螺方法。廣泛使用的氯硝柳胺、五氯酚鈉等藥物雖然能夠有效殺滅釘螺,但存在藥物使用量大,專(zhuān)一性差,對(duì)人和動(dòng)物都有一定毒害等不足。因此,尋找一種特異性殺滅釘螺的藥物具有

2、重要意義。
　　釘螺屬于軟體動(dòng)物門(mén)釘螺屬,是水陸兩棲動(dòng)物,常棲息于淡水水域。研究表明,釘螺的正常氧運(yùn)輸需要依靠一種細(xì)胞外的大分子蛋白質(zhì)——血藍(lán)蛋白(Hemocyanin, Hc),目前有關(guān)釘螺血藍(lán)蛋白的研究報(bào)道較少。本文提取并純化了湖北釘螺血藍(lán)蛋白；克隆鑒定釘螺血藍(lán)蛋白一功能域基因并在大腸桿菌中對(duì)其成功表達(dá)；另外,我們對(duì)該蛋白的結(jié)晶條件進(jìn)行了篩選并成功獲得了該蛋白的晶體；數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析等工作將為闡明血藍(lán)蛋白的輸氧機(jī)制和基本功

3、能打下基礎(chǔ),也為探索發(fā)現(xiàn)潛在的專(zhuān)一性防治藥物提供一定的依據(jù)。
　　具體地,我們利用CODEHOP引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)引物,克隆得到了釘螺血藍(lán)蛋白基因,經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST軟件比對(duì)分析,找到了釘螺血藍(lán)蛋白的一個(gè)完整功能域,命名為P,大小約為 1.3kb 左右。設(shè)計(jì)引物,提取釘螺血藍(lán)蛋白功能域 P(Oncomelania hupensis hemocyanin domain P, OhHP),OhHP 基因通過(guò) BamHI 和 Nd

4、eI 酶切位點(diǎn)插入表達(dá)載體pET28a,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 OhHP-pET28a,酶切鑒定及序列測(cè)定表明,目的基因片段連接正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示在47kD附近可見(jiàn)清晰條帶,與預(yù)計(jì)大小相符。大量表達(dá)目的蛋白,依次采用Ni2+親和層析及DEAE親和層析對(duì)蛋白進(jìn)行純化,能夠得到大量較純的蛋白。將純化好的蛋白濃縮到25mg/mL左右,采用懸滴蒸汽擴(kuò)散法,對(duì)