釘螺血藍蛋白功能域的克隆與重組表達研究.pdf

1、　　血吸蟲病是一種人、畜共患的寄生蟲病,我國是日本血吸蟲病流行區(qū)。在日本血吸蟲生活史中,釘螺(Oncomelania hupensis)是其唯一的中間宿主,日本血吸蟲病的地理分布與釘螺的分布相吻合,因此控制釘螺的繁衍與傳播是減少血吸蟲病傳播的有效手段。目前,化學滅螺是最常用的滅螺方法。廣泛使用的氯硝柳胺、五氯酚鈉等藥物雖然能夠有效殺滅釘螺,但存在藥物使用量大,專一性差,對人和動物都有一定毒害等不足。因此,尋找一種特異性殺滅釘螺的藥物具有

2、重要意義。
　　釘螺屬于軟體動物門釘螺屬,是水陸兩棲動物,常棲息于淡水水域。研究表明,釘螺的正常氧運輸需要依靠一種細胞外的大分子蛋白質——血藍蛋白(Hemocyanin, Hc),目前有關釘螺血藍蛋白的研究報道較少。本文提取并純化了湖北釘螺血藍蛋白；克隆鑒定釘螺血藍蛋白一功能域基因并在大腸桿菌中對其成功表達；另外,我們對該蛋白的結晶條件進行了篩選并成功獲得了該蛋白的晶體；數(shù)據(jù)收集和結構解析等工作將為闡明血藍蛋白的輸氧機制和基本功

3、能打下基礎,也為探索發(fā)現(xiàn)潛在的專一性防治藥物提供一定的依據(jù)。
　　具體地,我們利用CODEHOP引物設計方法設計引物,克隆得到了釘螺血藍蛋白基因,經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST軟件比對分析,找到了釘螺血藍蛋白的一個完整功能域,命名為P,大小約為 1.3kb 左右。設計引物,提取釘螺血藍蛋白功能域 P(Oncomelania hupensis hemocyanin domain P, OhHP),OhHP 基因通過 BamHI 和 Nd

4、eI 酶切位點插入表達載體pET28a,構建重組表達質粒 OhHP-pET28a,酶切鑒定及序列測定表明,目的基因片段連接正確。將重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中,IPTG誘導表達目的蛋白,SDS-PAGE分析結果顯示在47kD附近可見清晰條帶,與預計大小相符。大量表達目的蛋白,依次采用Ni2+親和層析及DEAE親和層析對蛋白進行純化,能夠得到大量較純的蛋白。將純化好的蛋白濃縮到25mg/mL左右,采用懸滴蒸汽擴散法,對