雜色鮑Toll樣受體信號(hào)通路分子的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、雜色鮑是我國(guó)南方沿海各省海水養(yǎng)殖的重要養(yǎng)殖貝類，但自90年代以來(lái)，養(yǎng)殖雜色鮑陸續(xù)爆發(fā)的大規(guī)模死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)的的健康可持續(xù)發(fā)展。引起雜色鮑大規(guī)模死亡原因是多方面的，其主要原因是養(yǎng)殖環(huán)境惡化、雜色鮑種質(zhì)衰退以及抗病力下降。改良種質(zhì)和培育抗病品系，開(kāi)發(fā)免疫增強(qiáng)劑等是解決目前困擾雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路，而所有這些途徑的基礎(chǔ)都需要對(duì)雜色鮑免疫防御機(jī)制有深刻的了解。
　　TLR信號(hào)通路在免疫過(guò)

2、程中具有重要作用，是研究雜色鮑免疫機(jī)制的首選對(duì)象之一。本研究通過(guò)EST序列分析和SMART RACE技術(shù)共獲得6條雜色鮑（small abalone）TLR信號(hào)通路分子基因：兩條革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（Gram-negative bacteria-binding proteins，GNBP）、白介素1受體相關(guān)激酶4（Interleukin-1 receptor-associated kinases4，IRAK-4）、白介素1受體相關(guān)激酶1

3、結(jié)合蛋白1（Interleukin-1 receptor-associated kinases1 binding protein1，IRAK1BP1）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）基因的全長(zhǎng)cDNA，分別命名為saGNBP1、saGNBP2、saIRAK-4、saIRAK1B

4、P1、saTRAF-6和saTNF-α，并采用Real time PCR分析這些基因的在雜色鮑組織表達(dá)、胚胎發(fā)育及經(jīng)副溶血弧菌感染后的表達(dá)情況。結(jié)果如下：
　　1）saGNBP1cDNA全長(zhǎng)為1430bp，編碼222個(gè)氨基酸。具有1個(gè)Glycoside hydrolase family16功能結(jié)構(gòu)域。saGNBP2cDNA全長(zhǎng)為1289bp，編碼396個(gè)氨基酸。具有1個(gè)Glycoside hydrolase family16功能結(jié)

5、構(gòu)域。
　　2）saIRAK-4 cDNA全長(zhǎng)為2062bp，編碼516個(gè)氨基酸。包含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域和死亡功能域。Real time PCR結(jié)果顯示saIRAK-4在鰓中表達(dá)量最高，在血淋巴中的表達(dá)量最低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過(guò)程中，saIRAK-4表達(dá)水平有顯著性變化?；【腥?2h后，saIRAK-4的表達(dá)量在鰓中顯著性升高(p<0.05)，24h后極顯著性升高(p<0.01)。在血淋巴和腎中，感染3h后表達(dá)量顯著性

6、變化，6-24h恢復(fù)到正常水平。原位雜交分析顯示，saIRAK-4在鰓上皮細(xì)胞中的雜交信號(hào)最強(qiáng)，說(shuō)明了其該基因在鰓上皮細(xì)胞中表達(dá)量最高。
　　3）saIRAK1BP1 cDNA全長(zhǎng)為1047bp，編碼249個(gè)氨基酸。具有1個(gè) SIMPL功能結(jié)構(gòu)域(45aa-240aa)，1個(gè)蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)（197aa-204aa）。N端具有一段跨膜區(qū)域，C端具有一個(gè)核定位信號(hào)（NLS）。Real time PCR結(jié)果顯示，saIRAK1BP1

7、在血淋巴中表達(dá)量最高，在外套膜、粘液腺和腎中的表達(dá)量最低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過(guò)程中，saIRAK1BP1表達(dá)水平有顯著性變化。在鰓中，弧菌感染后6h，表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到極顯著性水平（p<0.01）。在12h，表達(dá)量依然維持在很高的水平，達(dá)到顯著水平（p<0.05）。在24h時(shí)，表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平。在腎中，saIRAK1BP1在感染后6 h，表達(dá)量顯著上調(diào)（p<0.05），在12h和24h，表達(dá)水平恢復(fù)到正常。此外saIRAK1BP1

8、蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)。
　　4）saTRAF6 cDNA全長(zhǎng)為795bp讀框編碼170個(gè)氨基酸。包含1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。Real time PCR結(jié)果顯示，saTRAF6在腎和肝胰腺中表達(dá)量最高，在血淋巴中的表達(dá)量最低?；【腥竞?，在鰓和血淋巴中，saTRAF6感染后0-3h之間沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，而在感染6h，表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到顯著性水平（p<0.05），在12、24h時(shí)，表達(dá)水平恢復(fù)到正常。
　　5）saTNF-α

9、cDNA全長(zhǎng)為954bp編碼250個(gè)氨基酸。具有N端信號(hào)肽序列和一個(gè)TNF結(jié)構(gòu)域。Real time PCR結(jié)果顯示，saTNF-α在腎中表達(dá)量最高，在外套膜、上足、肝胰腺和血淋巴中的表達(dá)量較低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過(guò)程中，saTNF-α表達(dá)水平發(fā)生顯著性變化。弧菌感染后，在腎中，saTNF-α感染后3h表達(dá)水平顯著升高（p<0.05），在6-24h時(shí)，表達(dá)水平恢復(fù)到正常。在血淋巴中，saTNF-α感染后12h表達(dá)量顯著下降，達(dá)到顯著性水平