雜色鮑Toll樣受體信號通路分子的克隆及表達分析.pdf

1、雜色鮑是我國南方沿海各省海水養(yǎng)殖的重要養(yǎng)殖貝類，但自90年代以來，養(yǎng)殖雜色鮑陸續(xù)爆發(fā)的大規(guī)模死亡，造成了巨大的經濟損失，嚴重影響了雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)的的健康可持續(xù)發(fā)展。引起雜色鮑大規(guī)模死亡原因是多方面的，其主要原因是養(yǎng)殖環(huán)境惡化、雜色鮑種質衰退以及抗病力下降。改良種質和培育抗病品系，開發(fā)免疫增強劑等是解決目前困擾雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的必經之路，而所有這些途徑的基礎都需要對雜色鮑免疫防御機制有深刻的了解。
　　TLR信號通路在免疫過

2、程中具有重要作用，是研究雜色鮑免疫機制的首選對象之一。本研究通過EST序列分析和SMART RACE技術共獲得6條雜色鮑（small abalone）TLR信號通路分子基因：兩條革蘭氏陰性菌結合蛋白（Gram-negative bacteria-binding proteins，GNBP）、白介素1受體相關激酶4（Interleukin-1 receptor-associated kinases4，IRAK-4）、白介素1受體相關激酶1

3、結合蛋白1（Interleukin-1 receptor-associated kinases1 binding protein1，IRAK1BP1）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）基因的全長cDNA，分別命名為saGNBP1、saGNBP2、saIRAK-4、saIRAK1B

4、P1、saTRAF-6和saTNF-α，并采用Real time PCR分析這些基因的在雜色鮑組織表達、胚胎發(fā)育及經副溶血弧菌感染后的表達情況。結果如下：
　　1）saGNBP1cDNA全長為1430bp，編碼222個氨基酸。具有1個Glycoside hydrolase family16功能結構域。saGNBP2cDNA全長為1289bp，編碼396個氨基酸。具有1個Glycoside hydrolase family16功能結

5、構域。
　　2）saIRAK-4 cDNA全長為2062bp，編碼516個氨基酸。包含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域和死亡功能域。Real time PCR結果顯示saIRAK-4在鰓中表達量最高，在血淋巴中的表達量最低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過程中，saIRAK-4表達水平有顯著性變化。弧菌感染12h后，saIRAK-4的表達量在鰓中顯著性升高(p<0.05)，24h后極顯著性升高(p<0.01)。在血淋巴和腎中，感染3h后表達量顯著性

6、變化，6-24h恢復到正常水平。原位雜交分析顯示，saIRAK-4在鰓上皮細胞中的雜交信號最強，說明了其該基因在鰓上皮細胞中表達量最高。
　　3）saIRAK1BP1 cDNA全長為1047bp，編碼249個氨基酸。具有1個 SIMPL功能結構域(45aa-240aa)，1個蛋白質相互作用位點（197aa-204aa）。N端具有一段跨膜區(qū)域，C端具有一個核定位信號（NLS）。Real time PCR結果顯示，saIRAK1BP1

7、在血淋巴中表達量最高，在外套膜、粘液腺和腎中的表達量最低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過程中，saIRAK1BP1表達水平有顯著性變化。在鰓中，弧菌感染后6h，表達量顯著上調，達到極顯著性水平（p<0.01）。在12h，表達量依然維持在很高的水平，達到顯著水平（p<0.05）。在24h時，表達水平恢復到正常水平。在腎中，saIRAK1BP1在感染后6 h，表達量顯著上調（p<0.05），在12h和24h，表達水平恢復到正常。此外saIRAK1BP1

8、蛋白在大腸桿菌中得到表達。
　　4）saTRAF6 cDNA全長為795bp讀框編碼170個氨基酸。包含1個RING結構域。Real time PCR結果顯示，saTRAF6在腎和肝胰腺中表達量最高，在血淋巴中的表達量最低?；【腥竞?，在鰓和血淋巴中，saTRAF6感染后0-3h之間沒有發(fā)生顯著性變化，而在感染6h，表達量顯著上調，達到顯著性水平（p<0.05），在12、24h時，表達水平恢復到正常。
　　5）saTNF-α

9、cDNA全長為954bp編碼250個氨基酸。具有N端信號肽序列和一個TNF結構域。Real time PCR結果顯示，saTNF-α在腎中表達量最高，在外套膜、上足、肝胰腺和血淋巴中的表達量較低。在胚胎和幼蟲發(fā)育過程中，saTNF-α表達水平發(fā)生顯著性變化。弧菌感染后，在腎中，saTNF-α感染后3h表達水平顯著升高（p<0.05），在6-24h時，表達水平恢復到正常。在血淋巴中，saTNF-α感染后12h表達量顯著下降，達到顯著性水平