HIV-1復(fù)制抑制劑的尋找及作用機(jī)制的研究.pdf

1、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是HIV-1復(fù)制過(guò)程中重要的功能酶之一，催化以HIV-1基因組單鏈正鏈RNA為模板合成雙鏈DNA的過(guò)程，HIV-1感染細(xì)胞發(fā)生復(fù)制過(guò)程必須依賴逆轉(zhuǎn)錄酶，因此，逆轉(zhuǎn)錄酶是研發(fā)抗艾滋病藥物的重要靶點(diǎn)。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是由p66和p51雙亞基組成的異源二聚體，其功能亞基p66具有三種酶活性：RNA依賴的DNA聚合酶活性、DNA依賴的DNA聚合酶活性及RNase H活性，目前臨床上所有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑均為DNA聚合酶活性抑制劑

2、，病人長(zhǎng)期用藥后極易發(fā)生耐藥，因此，尋找新型HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑對(duì)研發(fā)抗艾滋病藥物具有重要意義。
　　 本論文應(yīng)用以HIV-1復(fù)制為靶點(diǎn)的VSVG/HIV-1uc藥理模型，從98個(gè)定向合成小分子噻唑類化合物中篩選得到22個(gè)活性化合物，IC50在0.01～20μmol·L-1之間。采用RNA依賴的DNA聚合酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)和RNase H活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)研究了其中四個(gè)化合物(GCB123、GCB130、GCB133和GCB162)的

3、作用機(jī)制，結(jié)果顯示噻唑類化合物是逆轉(zhuǎn)錄酶雙重抑制劑，對(duì)RNA依賴的DNA聚合酶活性和RNase H活性均有抑制作用：進(jìn)一步應(yīng)用2種常見(jiàn)耐藥型HIV-1重組病毒模型評(píng)價(jià)了22個(gè)噻唑類化合物的作用特點(diǎn)，結(jié)果顯示部分噻唑類化合物對(duì)HIVRT-K103N和HIVRT-Y181C耐藥突變株的復(fù)制有較好的抑制作用。
　　 本論文又應(yīng)用VSVG/HIV-luc模型從1000多個(gè)天然小分子提取物中篩選得到活性化合物RM-1和KHY-033，IC

4、50分別為0.420μmol·L-1和1.87μmol·L-1。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程模型考察了化合物RM-1和KHY-033對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的影響，結(jié)果顯示化合物RM-1和KHY-033均劑量依賴的抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中四個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)物的生成；采用RNA依賴的DNA聚合酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)和RNaseH活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)研究了RM-1和KHY-033對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的影響，結(jié)果顯示化合物RM-1通過(guò)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA

5、依賴的DNA聚合酶活性和RNase H活性抑制HIV-1復(fù)制；KHY-033通過(guò)抑制RNase H活性抑制HIV-1復(fù)制，對(duì)RNA依賴的DNA聚合酶活性無(wú)影響，提示這兩個(gè)化合物都是新結(jié)構(gòu)類型、新作用機(jī)制的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。
　　 應(yīng)用VSVG/MLV-GFP模型評(píng)價(jià)了化合物RM-1與KHY-033的特異性，以及應(yīng)用9種常見(jiàn)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥型HIV-1重組假病毒模型檢測(cè)耐藥突變株對(duì)其耐藥性，結(jié)果表明：化合物RM-1可劑量依

6、賴性、特異性的抑制HIV-1復(fù)制，且對(duì)HIVRT-K103N、HIVRT-L100I.K103N、HIVRT-K103N,p225H、HIVRT-K103N,G190A和HIVRT-K103N-V1081耐藥突變株的復(fù)制均有較好的抑制作用，而HIVRT-Y181C、HIVRT-Y188L、HIVRT-K103N,Y181C和HIVRT-K103N.Y188L對(duì)RM-1均產(chǎn)生耐藥，耐藥倍數(shù)分別為16.1、＞71.4、12和37.8倍?；?/p>