新型HIV免疫檢測平臺(tái)的建立.pdf

1、艾滋病是由人類免疫缺陷病病毒(HIV)感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。HIV快速檢測對病情控制、藥物療效以及血液篩查等也十分重要。傳統(tǒng)的檢測方法存在試劑消耗量大、分析時(shí)間長、操作過程繁瑣、靈敏度不高等缺點(diǎn)。采用芯片實(shí)驗(yàn)室檢測HIV可能解決以上問題。但是傳統(tǒng)檢測技術(shù)不能直接移植到芯片實(shí)驗(yàn)室中使用,因此,有必要建立一種適用于芯片實(shí)驗(yàn)室的檢測技術(shù)。 納米金磁顆粒是包被有納米金外殼的納米級(jí)磁性復(fù)合微粒,具有超順磁性、懸浮穩(wěn)定性等特

2、點(diǎn)可以很好地解決生物大分子在芯片實(shí)驗(yàn)室微通道中的操縱。同時(shí)納米金微粒具有大的比表面積,標(biāo)記方法簡單、效率高。本研究利用納米金磁微粒作為一種新的生物分子標(biāo)記技術(shù),結(jié)合核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立新型的HIVp24免疫檢測平臺(tái),完成了以下研究內(nèi)容： 第一、以納米金磁包被p24第一抗體,制備了納米金磁探針,其包被率達(dá)86.47％；采用納米金磁作為包被載體,使整個(gè)反應(yīng)在均相溶液中進(jìn)行,比傳統(tǒng)的固相反應(yīng)具有更高的反應(yīng)效率。 第二、以納米金

3、標(biāo)記p24第二抗體和報(bào)告DNA分子,制備了納米金探針,其抗體標(biāo)記率達(dá)87.12％,報(bào)告DNA標(biāo)記率達(dá)34.05％。以納米金作為抗體和報(bào)告DNA的連接物,將檢測p24的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)化為報(bào)告DNA的核酸信號(hào)。通過定量分析表明,一個(gè)納米金顆?？梢越Y(jié)合幾個(gè)抗體分子和幾十個(gè)報(bào)告DNA分子。 第三、建立了針對報(bào)告DNA檢測的TMA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),且初步實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測。與傳統(tǒng)的PCR相比,采用TMA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測核酸信號(hào)具有與PCR同等的擴(kuò)增效

4、率,但在恒溫條件下擴(kuò)增,不需要復(fù)雜的變溫系統(tǒng),由此簡化了芯片實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)。 第四、克隆并純化了TMA的工具酶-MMLV-RT,酶純度達(dá)96％,且具有商業(yè)RT酶的同等活力。 第五、建立了基于納米標(biāo)記技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的新型HIV p24檢測平臺(tái),其檢測靈敏度達(dá)0.1fg/mL。 該檢測技術(shù)與芯片實(shí)驗(yàn)室相結(jié)合,可以建立低成本、高靈敏度、便捷的免疫檢測平臺(tái),除了HIV檢測外,還可以用于其他病原微生物的檢測,在臨床診斷、