放射線對(duì)Balb-c小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射變化和耳蝸外毛細(xì)胞prestin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：
　　 1、探討單次放射線照射早期對(duì)Balb/c小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射和耳蝸外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白prestin表達(dá)的影響;
　　 2、探討單次不同劑量的放射線照射早期對(duì)Balb/c小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射和耳蝸外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白prestin表達(dá)的影響:
　　 3、探討放射線照射導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾的可能發(fā)病機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 選用正常出生后4周齡、排除外耳道及中

2、耳感染的雄性Balb/c小鼠，體重17～22g（由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），平均約20g。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1放療早期SNHL Balb/c小鼠模型的制備:
　　 小鼠稱重，2％戊巴比妥鈉溶液按0.3ml/100g的劑量行腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，在X線下定位，確定內(nèi)耳照射區(qū)域，然后于相同體位固定在直線加速器治療床上，美國(guó)Varian2100直線加速器6MeV電子線、劑量率為400cGy/m

3、in、源皮距100cm，用鉛檔塊避免呼吸道、消化道受照，參考深度為皮下1.5cm，分別給予各組受試小鼠右側(cè)內(nèi)耳單次不同劑量的放射線照射，在放射線照射后規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)各項(xiàng)待測(cè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2.2畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢測(cè):
　　 在放射線照射前后規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)各組受試小鼠分別進(jìn)行DPOAE檢測(cè)。用2％戊巴比妥鈉溶液0.3ml/100g腹腔注射麻醉受試小鼠，水溫40℃熱水袋保溫。將被檢測(cè)小鼠置于隔聲室中，用合適的探頭塞入小鼠外

4、耳道內(nèi)并使之密封，當(dāng)刺激信號(hào)平穩(wěn)后進(jìn)行檢測(cè)。兩個(gè)初始音f1和f2的頻率比(f2/f1)為1.22，強(qiáng)度相同(L1=L2)，進(jìn)行80dB SPL強(qiáng)度水平的檢測(cè);測(cè)試并記錄0.5-12kHz頻率范圍內(nèi)各個(gè)頻率的DPOAE幅值、Noise值和各頻率引出率情況，繪制成DPOAE聽(tīng)力曲線圖及DPOAE輸入輸出函數(shù)曲線(DP-I/O)，比較放射線照射前后聽(tīng)覺(jué)生理功能的變化情況。
　　 2.3 Western Blotting分析presti

5、n的表達(dá)情況:
　　 取兩只小鼠迅速斷頭，分別快速摘下右側(cè)耳蝸（2只）放入研缽中，加入液氮后研磨，研磨成粉末后分裝在離心管中，加入200ul的RIPA裂解液，充分裂解后，12000g離心10分鐘，取上清。加入6×蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，-20℃保存?zhèn)溆?。各組取總蛋白200ug經(jīng)10％ SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。然后用20ml含5％脫脂奶粉的TBS緩沖液4℃封閉18小時(shí)，封閉后將雜交膜的β-actin

6、和目的蛋白條帶剪開(kāi)，分別放入雜交袋中，加入用5％脫脂奶粉稀釋的一抗，β-actin一抗稀釋濃度為1∶500，目的蛋白一抗（羊抗鼠prestin多克隆抗體）稀釋濃度為1∶200。4℃孵育18小時(shí)。一抗孵育后的雜交膜用1×TBST漂洗3次，每次10min，然后分別放入雜交袋中，加入用5％脫脂奶粉稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，β-actin對(duì)應(yīng)的二抗稀釋濃度為1∶2000，目的蛋白對(duì)應(yīng)的二抗(兔抗羊IgG)稀釋濃度為1∶3000。室溫孵育1.5小

7、時(shí)。然后用1×TBST洗膜3次，每次10分鐘。最后在暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，曝光，依次放入顯影液和定影液。選用β-actin作為內(nèi)參照，并用凝膠成像系統(tǒng)軟件SC805進(jìn)行分析結(jié)果。各組中prestin與β-actin吸光度的比值與正常組比較，來(lái)判斷其表達(dá)變化。
　　 2.4熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)prestin mRNA的表達(dá):
　　 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找出小鼠prestin基因序列。使用Primer5.0軟

8、件設(shè)計(jì)小鼠prestin引物、探針，內(nèi)參β-actin引物及探針序列。首先將各組取得的耳蝸組織在液氮中磨成粉末（全程保持液氮濕潤(rùn)），取50～100mg的樣品粉末置于無(wú)RNAase的1.5ml離心管中，按Biozol公司提供的Biozol RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明提取RNA。然后用TaKaRa公司提供的Recombinant DNaseⅠ(RNase-free)對(duì)進(jìn)行RNA進(jìn)行純化，純化后取3～4μl RNA樣品進(jìn)行快速的非變性瓊脂糖凝

9、膠（1.0％膠濃度）180v10min電泳來(lái)檢測(cè)RNA的完整性并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。然后按照Toyobo公司提供的ReverTraAce-a-反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)將變性總RNA反轉(zhuǎn)成第一鏈cDNA，反應(yīng)結(jié)束后保存于-20℃待用。將目的基因和內(nèi)參基因的cDNA樣本分別取樣在熒光定量PCR儀(ABI7500)上進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20ul，反應(yīng)條件為95℃2min;95℃15S，60℃

10、40S，45個(gè)循環(huán)，60℃獲取熒光信號(hào);循環(huán)結(jié)束后從65℃升高到95℃獲取溶解曲線。
　　 2.4統(tǒng)計(jì)方法
　　 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS13.0，進(jìn)行One-way ANOVA分析，取α=0.05，方差齊者用LSD法行組間兩兩比較，方差不齊者用Dunnett's T3法行組間兩兩比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立了放療早期SNHL Balb/c小鼠模型;
　　 2、給予總放射劑量為16Gy的放

11、射線照射小鼠時(shí):放射線照射前組、照射后第3天組及照射后第7天組小鼠在0.5、1和2kHz時(shí)DPOAE引出率均較低，在3、4、6、8、10和12kHz時(shí)DPOAE引出率均為100％;在3、4、6、8、10和12kHz時(shí)照射后第3天組和照射后第7天組小鼠的DPOAE幅值較照射前組小鼠均降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，照射后第7天組小鼠的DPOAE幅值在大部分頻率上要比照射后第3天組小鼠的DPOAE幅值要低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);

12、從10和12kHz時(shí)的I/O曲線上可以看到照射后第3天組和照射后第7天組小鼠較照射前組小鼠的曲線明顯降低，即在10和12kHz時(shí)各種相對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度下照射后第3天組和照射后第7天組小鼠較照射前組小鼠的DPOAE幅值明顯降低;照射后第3天組和照射后第7天組小鼠的耳蝸prestin及其基因prestin mRNA的表達(dá)較照射前組小鼠出現(xiàn)一致性下降，且照射后第7天組小鼠的耳蝸prestin及其基因prestin mRNA的表達(dá)較照射后第3天組

13、小鼠下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、分別給予0、8、12、16Gy劑量的放射線照射時(shí):各照射組小鼠在第7天檢測(cè)3、4、6、8、10和12kHz時(shí)的DPOAE幅值均較正常對(duì)照組小鼠明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著放療劑量的增加，DPOAE幅值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在部分頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各放療組小鼠在放射線照射后第7天檢測(cè)耳蝸prestin及其基因prestin mRNA的表達(dá)較正常

14、對(duì)照組小鼠均下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著放射線劑量的增加，小鼠耳蝸prestin及其基因prestin mRNA的表達(dá)逐漸下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、單次大劑量的放射線照射早期即可損傷小鼠的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致小鼠耳蝸外毛細(xì)胞膜上的馬達(dá)蛋白prestin及其基因prestin mRNA的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)損害了小鼠的聽(tīng)覺(jué)生理功能;
　　 2、不同劑量的放射線照射對(duì)小鼠的內(nèi)