菌群構(gòu)成與細(xì)菌性陰道病的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:細(xì)菌性陰道病(BV)是育齡期婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是由于陰道內(nèi)微生態(tài)平衡失調(diào)，非正常陰道菌生長(zhǎng)過(guò)盛所致對(duì)陰道有保護(hù)作用的乳酸桿菌減少，厭氧類(lèi)細(xì)菌大量繁殖導(dǎo)致的一類(lèi)多微生物病。BV是妊娠婦女最主要的并發(fā)疾病，與胎兒低體重、早產(chǎn)、新生兒死亡及產(chǎn)婦繼發(fā)感染等不良妊娠結(jié)局有關(guān)。臨床用甲硝唑和克林霉素按標(biāo)準(zhǔn)方法治療BV，3月內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)30％，其中最主要原因是對(duì)BV的病因，特別是病原學(xué)缺乏深入了解，很多細(xì)菌不易培養(yǎng)，導(dǎo)致陰道分泌物的病原

2、菌組成和分類(lèi)研究進(jìn)展緩慢，因而缺乏有效的預(yù)防和治療措施。
　　 近年來(lái)，不依靠細(xì)菌培養(yǎng)測(cè)定細(xì)菌種屬的分子生物學(xué)方法得到應(yīng)用推廣，使研究者可以探索微生物群落內(nèi)部的種群結(jié)構(gòu)和變遷。本項(xiàng)目在前期研究的基礎(chǔ)上，以BV陽(yáng)性和陰性婦女為研究對(duì)象，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和DNA測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌16S rDNA的特征序列信息，將16S rDNA與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從“屬”、“種”水平對(duì)陰道分泌物中的細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行鑒定。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)

3、計(jì)算細(xì)菌種屬的相對(duì)含量。采用對(duì)應(yīng)分析法證明BV相關(guān)細(xì)菌，采用logistic回歸分析不同菌群組成以及其他相關(guān)因素與BV的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步防治研究提供依據(jù)。
　　 研究目的:探討與BV相關(guān)的細(xì)菌種屬；研究正常陰道細(xì)菌和BV相關(guān)菌的相對(duì)含量與BV的相關(guān)性；探討人口學(xué)特征以及衛(wèi)生習(xí)慣等宏觀因素與BV的關(guān)聯(lián)性，為BV的病因研究提供線索，為BV的防治研究提供依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法:
　　 一、陰道微生物群落的檢測(cè)方法:

4、采用革蘭氏染色Nugent評(píng)分法結(jié)合商業(yè)試劑盒對(duì)BV作出臨床診斷。以目前常用的DGGE方法為基礎(chǔ)，重新設(shè)計(jì)了DGGE實(shí)驗(yàn)裝置的關(guān)鍵部件制膠板組件，擴(kuò)展了DGGE方法的條帶分辨率范圍和裝置使用的靈活性，并采用切膠重新PCR擴(kuò)增并測(cè)序的手段獲得細(xì)菌的16S rDNA遺傳信息，并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以序列相似程度≥97.5％作為序列同源性標(biāo)準(zhǔn)。利用DGGE凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)細(xì)菌標(biāo)本中各細(xì)菌種屬的相對(duì)含量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)陰道微環(huán)境細(xì)菌群落的定性和

5、定量分析的有機(jī)結(jié)合。
　　 二、陰道菌群構(gòu)成及其他相關(guān)因素與BV的相關(guān)性(BV的危險(xiǎn)因素研究):用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查問(wèn)卷調(diào)查196名育齡期婦女，問(wèn)卷內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、衛(wèi)生習(xí)慣、婚育史以及主要婦科診斷等。采用對(duì)應(yīng)分析法確定BV相關(guān)細(xì)菌，采取卡方檢驗(yàn)分析不同細(xì)菌種屬在BV陽(yáng)性組和BV陰性組的檢出率差異，采用t檢驗(yàn)分析不同菌屬的相對(duì)含量在2組間的差異，logistic回歸分析不同菌群組成以及其他相關(guān)因素與BV的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。
　　

6、 研究結(jié)果:
　　 第一部分陰道微生物群落檢測(cè)方法的研究
　　 1.全部196名婦女共檢出細(xì)菌種屬59種，正常組檢出14種，BV組檢出55種。
　　 2.68名BV陰性婦女中，每名婦女可檢出1-5個(gè)不同菌屬，平均檢測(cè)到2.59種；128名BV陽(yáng)性婦女中，每名婦女可檢測(cè)到1-9個(gè)不同菌屬，平均檢測(cè)到4.05種，二者比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。
　　 3.正常組檢出率在前5位的細(xì)菌分別為惰性乳酸

7、桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillus ultunensis)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、陰道加特納菌(Gardnerella vaginalis)和短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)；BV組檢出率在前5位的細(xì)菌分別為惰性乳酸桿菌(Lactobacillus iners)、陰道加特納菌(Gardnerella vag

8、inalis)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillusultunensis)、陰道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和fungorum伯克霍爾德氏菌(Burkholderia fungorum)。
　　 4.細(xì)菌進(jìn)化關(guān)系分析顯示59中檢出細(xì)菌分為2個(gè)大類(lèi)，分別定義為陰道正常菌群，和BV相關(guān)菌群。其中陰道正常菌群包括雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、massiliae消化

9、鏈球菌(Peptostreptococcus massiliae)、Amnionii纖毛菌屬(Leptotrichia amnionii)、惰性乳酸桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳酸桿菌(Lactobacillus ultunensis)、和約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)共6種。
　　 5.研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)檢出的細(xì)菌種屬16S rDNA特征DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列

10、的同源性<97.5％(96.835％vs Lactobacillus ultunensis；86.184％vs Mycoplasma muris)，可能為細(xì)菌新變種。
　　 第二部分細(xì)菌性陰道病的危險(xiǎn)因素研究在第一部分的研究基礎(chǔ)上，本部分研究陰道菌群的構(gòu)成和其他因素與BV發(fā)生的相關(guān)性，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.與正常組和BV組相關(guān)聯(lián)的陰道菌群發(fā)現(xiàn)與正常組相關(guān)聯(lián)的細(xì)菌為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bi

11、fidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、惰性乳桿菌(Lactobacillus iners)、ultunensis乳桿菌9Lactobacillus ultunensis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；與BV組相關(guān)聯(lián)的細(xì)菌為Algoriphagus aquatilis、陰道阿托波氏菌(陰道奇異菌)(Atopobiumvaginae)、fungorum伯克霍爾德氏菌

12、屬(Burkholderia fungorum)、陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。
　　 2.正常組和BV陽(yáng)性組陰道微生態(tài)構(gòu)成特點(diǎn)
　　 (1)乳酸桿菌在2個(gè)組中均為檢出的優(yōu)勢(shì)菌，總?cè)樗釛U菌Lactobacillus在病例組和正常組中的檢出率分別為92.97％和95.59％，檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher’s ex

13、actP=0.548)，但其在正常組中的含量顯著高于BV陽(yáng)性組。
　　 (2)陰道加特納菌(Gardnerella vaginalis)作為細(xì)菌性陰道病的標(biāo)志性細(xì)菌，在BV組中的檢出率和相對(duì)含量均高于正常組，但正常組也有比較高的檢出率，所以不能單純以陰道加特納菌陽(yáng)性與否作為診斷BV的依據(jù)。
　　 (3)發(fā)現(xiàn)其他BV相關(guān)菌包括陰道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)和普雷沃菌(Prevotella timone

14、nsis)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
　　 (4)研究發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia fungorum)、micronuciformis巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、Algoriphagus aquatilis與BV相關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道較少，其與BV的真實(shí)聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究確證。
　　 (5)BV陽(yáng)性組的細(xì)菌載量顯著高于正常組。
　　 3.多因素統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)BV的危險(xiǎn)因素初

15、婚年齡較小、陰道pH值偏高、陰道乳酸桿菌含量低是發(fā)生BV的危險(xiǎn)因素；妊娠的婦女患BV的危險(xiǎn)性是已生育婦女的36倍，未孕育的婦女患BV的危險(xiǎn)性是已生育婦女的4.08倍，但關(guān)聯(lián)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)常陰道沖洗(用水洗或用消毒液洗)的婦女與偶爾陰道沖洗的婦女相比有更高的患BV危險(xiǎn)性；具有高中及以上學(xué)歷者患BV的危險(xiǎn)是初中及以下學(xué)歷者的4.98倍。
　　 結(jié)論:
　　 1.除陰道加特納菌Gardnerella vaginalis、陰

16、道阿托波氏菌(陰道奇異菌)(Atopobiumvaginae)作為細(xì)菌性陰道病的標(biāo)志性細(xì)菌外，本研究發(fā)現(xiàn)其他BV相關(guān)菌包括(Algoriphagus aquatilis)、fungorum伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia fungorum)、genomosp巨球形菌(Megasphaera genomosp)。
　　 2.BV陽(yáng)性陰道微環(huán)境細(xì)菌種類(lèi)和細(xì)菌總量顯著高于正常對(duì)照，而正常對(duì)照的乳酸桿菌含量顯著高于BV陽(yáng)性組。