腸出血性大腸桿菌O157-H7z3672基因的敲除與毒力評(píng)價(jià).pdf

1、病原微生物的流行對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了重大威脅，研究病原微生物與宿主相互作用的分子基礎(chǔ)，對(duì)預(yù)防與治療感染性疾病、改善人類(lèi)健康具有重要意義，它也一直是醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題之一。生物信息學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科已廣泛地滲透到生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，發(fā)揮著巨大作用。隨著越來(lái)越多的全基因組序列的測(cè)定完成，對(duì)基因組序列進(jìn)行比較分析，探索序列結(jié)構(gòu)與病原微生物致病能力間關(guān)系的比較基因組學(xué)也應(yīng)運(yùn)而生，為病原微生物學(xué)的研究注入了新的活力。在前期研究中，我們應(yīng)用生物信

2、息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白家族(FlxA-likeproteins)，分析表明該蛋白家族可能參與細(xì)菌與宿主相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌的重要效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。
　　 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)O157：H7是常見(jiàn)的腸道致病菌，感染該菌可引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎，溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，致死率達(dá)5％～10％

3、。1982年，Riley等報(bào)道了由O157：H7引起的出血性結(jié)腸炎的暴發(fā)流行，這也是把O157：H7確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌的首次報(bào)道。隨后在加拿大、日本、英國(guó)、澳大利亞等地發(fā)生了多起該菌的感染流行。1999年，在我國(guó)安徽、江蘇兩省曾暴發(fā)流行O157感染性腹瀉，患者超過(guò)2萬(wàn)人，死亡177人，流行時(shí)間7個(gè)月，可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大的一次。我國(guó)已將EHEC列為21世紀(jì)可能對(duì)國(guó)人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。由于O157：H7的

4、感染呈現(xiàn)暴發(fā)流行趨勢(shì)，感染后對(duì)人體有強(qiáng)烈的致病性與致死性，而且抗生素治療可能會(huì)加劇病情，因此，它已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。O157培養(yǎng)容易、傳播途徑多樣，感染性很強(qiáng)，<100 CFU(菌落形成單位)即可致病，且多數(shù)病癥較為嚴(yán)重。它也被美國(guó)疾病控制中心(CDC)列為B類(lèi)生物恐怖病原體嚴(yán)加防范。通過(guò)近三十多年的研究，我們對(duì)O157：H7的致病機(jī)制已經(jīng)有了初步認(rèn)識(shí)，但尚未完全闡明，了解感染的致病機(jī)理對(duì)預(yù)防和治療由該菌引起的流行性疾病具有重

5、要的理論指導(dǎo)意義。
　　 我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的新蛋白家族(FlxA-like proteins)成員中存在Z3672蛋白，它是一個(gè)來(lái)源于O157：H7的假想蛋白，根據(jù)預(yù)測(cè)信息我們推測(cè)它很可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應(yīng)蛋白(毒力蛋白)。因此，通過(guò)對(duì)O157：H7 Z3672蛋白的研究，有望發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子，從而推進(jìn)O157：H7致病的分子基礎(chǔ)研究工作，為進(jìn)一步了解FlxA-like蛋白家族在細(xì)

6、菌與宿主相互作用過(guò)程中所發(fā)揮的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究通過(guò)Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了O157：H7z3672缺失突變株。首先經(jīng)過(guò)PCR、酶切、連接等步驟，構(gòu)建了兩端同源序列分別約500bp的z3672基因長(zhǎng)同源臂打靶片段，該片段連接在pET-24a載體上。然后通過(guò)pKOBEG質(zhì)粒介導(dǎo)的Red重組，使電擊轉(zhuǎn)化入菌體內(nèi)部的同源臂打靶片段與O157：H7基因組序列進(jìn)行了同源重組，經(jīng)過(guò)抗性篩選、PCR鑒定以及測(cè)序分析，成功獲得了O15

7、7：H7z3672缺失突變體。通過(guò)Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)，針對(duì)z3672基因在野生株是否轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了檢測(cè)，比較O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株中z3672基因的轉(zhuǎn)錄差異，并且證明了在O157：H7野生株中z3672基因存在轉(zhuǎn)錄活性。
　　 在獲得了O157：H7z3672缺失突變株后，主要對(duì)z3672基因的功能進(jìn)行了初步研究。一方面，利用雙向電泳以及蛋白質(zhì)譜鑒定的方法，對(duì)O157：H7野生株和O15

8、7：H7z3672缺失突變株進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。研究表明，在O157：H7z3672缺失突變株中，外膜蛋白A(OmpA)的表達(dá)量升高。通過(guò)Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)從基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果證明，Real-Time PCR與雙向電泳結(jié)果一致，因此，在O157：H7中，z3672基因與ompA(外膜蛋白A)基因存在某種聯(lián)系，敲除Z3672基因可以提高外膜蛋白A的表達(dá)水平。另一方面，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，比較O157：

9、H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株對(duì)真核細(xì)胞(HeLa)造成的A/E損傷是否存在差異。利用細(xì)胞骨架蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察O157：H7野生株與O157：H7z3672缺失突變株分別粘附HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulin改變差異。實(shí)驗(yàn)表明，敲除z3672基因前后，O157：H7對(duì)細(xì)胞骨架蛋白Actin，Keratin，Tubulm改變差異并不明顯。這也說(shuō)明，Z3672蛋白不是O157：H7

10、中影響真核細(xì)胞骨架改變的核心因子。
　　 在細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白熒光染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)的O157：H7感染HeLa細(xì)胞后可以形成明顯的肌動(dòng)蛋白聚集現(xiàn)象。于是對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了初步探索。利用不同的培養(yǎng)基條件(LB，DMEM，DMEM含10％FBS，DMEM含終濃度為25m mol/L HEPES)培養(yǎng)O157：H7并對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)，粘附HeLa細(xì)胞，HeLa細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚集狀況以及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了初步分

11、析。結(jié)果表明，雖然在DMEM含10％FBS中生長(zhǎng)最慢，但是O157：H7粘附性以及對(duì)肌動(dòng)蛋白聚集的能力是最強(qiáng)的。由于O157：H7對(duì)真核細(xì)胞的A/E損傷主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是其對(duì)真核細(xì)胞的粘附作用；二是其對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚集能力。因此，以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了利用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的O157：H7對(duì)真核細(xì)胞的A/E損傷能力增強(qiáng)，進(jìn)而其致病能力也增強(qiáng)了。
　　 本研究構(gòu)建了O157：H7z3672缺失突