人胸腺素α原基因的克隆表達(dá)及其生物活性的初步研究.pdf

1、Goldstein等于1966年自小牛胸腺中首次提取到具有免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)，并命名為胸腺素。其后經(jīng)過(guò)30余年的臨床研究，一些胸腺激素或胸腺肽制劑已作為一種免疫調(diào)節(jié)劑類藥物廣泛應(yīng)用于臨床，在治療或減輕原發(fā)性免疫缺陷、病毒或細(xì)菌感染、自身免疫和癌癥等疾病方面取得了較好的療效。目前臨床上所用的胸腺素主要是由小牛胸腺中純化得到的胸腺素F5組分(TF5)，其中含有40余種肽類，相對(duì)分子質(zhì)量為1000-15000Da。胸腺素α原(ProTα)的N

2、端含有完整的胸腺素α1(Tα1)28肽。ProTα具有與Tα1相似甚或更高的免疫調(diào)節(jié)活性。由于在免疫和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控方面的廣泛作用，ProTα在其被發(fā)現(xiàn)后的20多年里，一直作為胸腺素家族中的研究重點(diǎn)而備受人們的關(guān)注。 本實(shí)驗(yàn)從中國(guó)人外周血中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出ProTα基因，將成熟ProTα的編碼框序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，在氨芐青霉素平板上篩選抗性轉(zhuǎn)化子，并

3、經(jīng)PCR，雙酶切鑒定，挑選出陽(yáng)性克隆子，DNA測(cè)序正確，表明成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-α。將重組載體pGEX-α化宿主菌BL21(DE3)，異丙基-β-D-半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE分析鑒定目的蛋白，分析發(fā)現(xiàn)與預(yù)期外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?7KD左右增加了一條特異蛋白條帶，且目的蛋白是以可溶的形式表達(dá)，凝膠成像儀分析其表達(dá)量高達(dá)27.9％。用親和層析分離純化后的ProTα融合蛋白作為抗原，與完全弗氏佐

4、劑完全乳化，采用腋下多點(diǎn)注射免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過(guò)31天的免疫，獲得兔抗ProTα的多克隆抗體。采用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，測(cè)得抗體效價(jià)超過(guò)l：51200，蛋白印跡分析結(jié)果顯示，該抗體能特異性與ProTα原產(chǎn)生明顯免疫親和反應(yīng)。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示，該融合蛋白在1.0-0.0001μg/只范圍都具有明顯抑制S180在小鼠皮下的生長(zhǎng)，尤其對(duì)已經(jīng)腹水接種S180細(xì)胞的荷瘤小鼠再皮下注射重組融合蛋白，0.0001μg/只的

5、濃度并具有顯著延長(zhǎng)小鼠壽命的效果，尤其是1μg只濃度以上的劑量即可達(dá)到超過(guò)60天，并且完全存活的效果。在抗氧化能力活性檢測(cè)中，選擇4個(gè)月齡，體重在40克以上的老齡老鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)注射重組融合蛋白，不僅可以顯著提高老鼠的胸腺指數(shù)，同時(shí)可以顯著提高老鼠抗氧化能力。本研究采用GST原核表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)融合蛋白ProTa，制備了兔抗ProTa多克隆抗體，所制備的抗體具有很強(qiáng)的靈敏性和特異性，初步探索重組ProTa的抗腫瘤，抗氧化及延長(zhǎng)荷瘤小鼠