塞來昔布誘導卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機制研究.pdf

1、背景：卵巢癌是所有婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)患者占所有卵巢癌患者的90％[1]。由于多數(shù)上皮性卵巢癌在診斷時就已發(fā)展至晚期，即使聯(lián)合手術與先進的化療藥物進行治療，患者的五年生存率仍徘徊在30％左右[2]。上皮性卵巢癌患者高復發(fā)率和死亡率的主要原因是患者在診斷時就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。網(wǎng)膜、腹膜、膈肌及腸系膜等處的轉(zhuǎn)移已被證實是卵巢癌患者的不良預后因素[3]。因此闡明

2、卵巢癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機制在改善卵巢癌患者的診斷、治療及預后有著重要的意義。已有大量研究證實，炎癥參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]。環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是一種在炎癥過程中誘導表達升高的酶，其主要作用是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素[5]。同時環(huán)氧化酶-2在人類上皮性癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)的發(fā)生中起關鍵作用[6-8]。這些研究

3、均支持將選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑，非甾體類抗炎藥塞來昔布(Celecoxib)用于癌癥的治療。體外實驗證實塞來昔布可以調(diào)控細胞周期，促進細胞凋亡和抑制血管生成[9]。在非小細胞肺癌、結直腸癌、口腔黏膜癌前病變及上皮性卵巢癌的治療中，塞來昔布作為輔助用藥已經(jīng)進入臨床試驗階段[10-13]。然而這些臨床試驗并未證實塞來昔布可以改善癌癥患者的預后。盡管在一項針對45位復發(fā)性卵巢癌患者的臨床研究中患者對塞來昔布的治療反應較好，但是在另一項151

4、位卵巢癌患者的臨床研究中，塞來昔布聯(lián)合多西紫杉醇和卡鉑的治療并未改善患者的無病生存期和總生存率[13，14]?？梢娙麃砦舨荚诼殉舶┑闹委熤写嬖跔幾h，其中的機制需要進一步闡明。
　　目的：⑴研究塞來昔布作用于人卵巢癌細胞系A2780和SKOV3后對細胞形態(tài)、細胞增殖和細胞侵襲性的影響;⑵研究塞來昔布對卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導作用，檢測塞來昔布作用前后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白的表達水平;⑶探討ZEB1表達在塞來昔布誘導卵巢癌細胞發(fā)

5、生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，研究塞來昔布誘導卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制。
　　方法：①MTT法檢測不同濃度塞來昔布(0，5，10，15μM)對A2780和SKOV3的生長抑制作用;②相差倒置顯微鏡觀察塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細胞形態(tài)的改變并拍攝照片;③Transwell侵襲小室檢測塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細胞侵襲性的影響，在相差倒置顯微鏡下計數(shù)粘附于侵襲小室底部的細胞數(shù);④蛋白印跡法檢測塞來

6、昔布(0，5，10，15μM)作用前后A2780和SKOV3細胞中上皮表型E-cadherin和Keratin、間質(zhì)表型N-cadherin和Vimentin以及p-AKT、p-ERK和ZEB1表達的變化;⑤ZEB1小干擾NRA(Small-interfering RNA，siRNA)作用于A2780和SKOV3細胞后再檢塞來昔布對細胞的侵襲能力的影響和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導作用。
　　結果：⑴塞來昔布對卵巢癌細胞生長抑制作用的研究:

7、應用MTT法檢測不同濃度塞來昔布（0，5，10，15μM）作用于A2780和SKOV3細胞，48小時后檢測塞來昔布對細胞的增殖的抑制情況，結果顯示:與對照組相比，各濃度組均未對細胞的增殖有明顯的抑制作用(P.0.05)。⑵塞來昔布對卵巢癌細胞形態(tài)影響的研究:應用相差倒置顯微鏡觀察塞來昔布(10μM)對細胞形態(tài)的改變，結果顯示:A2780細胞的空白對照組細胞呈現(xiàn)較規(guī)則的小三角形的上皮細胞形態(tài)，而實驗組的細胞則出現(xiàn)伸長呈現(xiàn)梭行改變;而本身形

8、態(tài)就不規(guī)則的SKOV3細胞形態(tài)逐漸變得規(guī)則清晰，并伸展出較長觸角。⑶塞來昔布對卵巢癌細胞侵襲性影響的研究:應用Transwell侵襲小室檢測塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細胞侵襲性的改變，結果顯示:與對照組相比較，實驗組細胞的侵襲性明顯增加(P≤0.001)。⑷塞來昔布誘導卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制的研究:應用蛋白免疫印跡方法檢測塞來昔布（0，5，10，15μM）對A2780和SKOV3細胞上皮E-cadherin、

9、Keratin和間質(zhì)表型N-cadherin、Vimentin以及p-AKT、p-ERK和ZEB1表達的影響，結果顯示:與對照組相比，實驗組的上皮表型E-cadherin和Keratin表達明顯降低，而間質(zhì)表型N-cadherin和Vimentin表達則明顯升高，并且隨著藥物濃度的增加表型表達變化越明顯;實驗組p-AKT、p-ERK和ZEB1表達也隨著藥物濃度的增加逐漸增加。⑸塞來昔布促進卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制的確認:在加

10、入塞來昔布前應用ZEB1小干擾NRA(Small-interfering RNA，siRNA)預先干擾A2780和SKOV3細胞，結果顯示:干擾掉ZEB1的細胞再加入塞來昔布(10μM)并不能增加細胞的侵襲性，也不能使細胞的上皮及間質(zhì)的表型表達發(fā)生改變。
　　結論：①塞來昔布能夠誘導細胞發(fā)生形態(tài)改變，使細胞逐漸變得細長呈現(xiàn)出間質(zhì)樣細胞的形態(tài);能夠明顯增加卵巢癌細胞的侵襲性;②塞來昔布能夠明顯促進人卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且具有